羅丹明123染色檢測線粒體膜電位.doc

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1、羅丹明123染色檢測線粒體膜電位??化學名：Rh123羅丹明123????別名：　Rhodamine123;Rh123??分子式：C21H17CLN2O3??分子量：380.82?????配制：羅丹明123粉劑用甲醇配成1mg/mlde儲備液，染色時用DPBS緩沖液將其稀釋為所需濃度??保存：冰箱-20度避光一、檢測原理：羅丹明123（Rhodamine123）是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑。其在正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質(zhì),熒光強度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時，線粒體膜完整

2、性破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，引起線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩潰,Rh123重新釋放出線粒體,從而發(fā)出強黃綠色熒光，可用熒光顯微鏡、熒光光度計或流式細胞儀檢測，通過熒光信號的強弱來檢測線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生，可用于培養(yǎng)的細胞或從組織中提取出的線粒體的膜電位檢測。二、使用方法：1．細胞染色及分析????（1）培養(yǎng)細胞1×106/mL重懸于培養(yǎng)基中；????（2）加入羅丹明123染液0.1μg/mL～50μg/mL（根椐細胞種類不同而濃度不同，一般3～10μg/mL）；????（3）37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育1

3、～30min（根椐細胞種類不同而不同，一般10min）；????（4）離心以培養(yǎng)基洗細胞兩次；2．組織提取的線粒體染色及分析????（1）按常規(guī)方法提取的線粒體，用適量的1×AssaysBuffer（將5×AssaysBuffer用水稀釋5倍）重懸；????（2）常規(guī)方法進行蛋白含量測定后，用1×AssaysBuffer調(diào)配成3mg/mL的線粒體溶液；????（3）取2mL1×AssaysBuffer和1mL線粒體溶液；????（4）加入適量待測化合物（同時設(shè)空白對照組），250C保溫min；????（5）加入羅丹明123染

4、液10μL；????（6）熒光光度計檢測：上述混合液全部加入石英比色皿中，置于250C下測定，激發(fā)波長488～505nm，發(fā)射波長530nm，連續(xù)記錄從0min～30min內(nèi)熒光強度的變化。三、注意事項1、操作時需戴手套2、羅丹明123為通透性染料，可以自由進入細胞3、孵育時，必須避免光照4、使用時，避免污染母液5、染色完成后，即刻進行熒光檢測分析