熒光定量PCR簡(jiǎn)介.ppt

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1、熒光定量PCR簡(jiǎn)介目錄目錄4熒光定量PCR原理123定量PCR的實(shí)驗(yàn)流程幾種定量方法的比較StepOnePlus與ViiA7比較及應(yīng)用QPCR定量的常見(jiàn)問(wèn)題5什么是PCR1.1什么是PCR?1、熒光定量PCR原理理想的PCR以2n次方擴(kuò)增,即:DNAn=DNA0×2nQPCR定義RealtimeQ-PCR通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一次循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。1.2QPCR定義1.3數(shù)學(xué)原理RealtimeQ-PCR動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)可以分成四個(gè)階段:基線(xiàn)階段,指數(shù)增長(zhǎng)期、線(xiàn)性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期?;€(xiàn)→閾值→CT值→[DNA]0定量PC

2、R的幾個(gè)重要的參數(shù):基線(xiàn)就是擴(kuò)增曲線(xiàn)的水平部分。什么是閾值?基線(xiàn)(空白)信號(hào)的產(chǎn)生是由于背景引起的。默認(rèn)閾值=基線(xiàn)(背景)信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差x10什么是CT值?熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)上人為設(shè)定的一個(gè)值,一般熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。從基線(xiàn)到指數(shù)增長(zhǎng)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)被稱(chēng)為CT值(ThresholdValue)。PCR擴(kuò)增的數(shù)學(xué)模型擴(kuò)增產(chǎn)物遵循理論方程:[DNA]n=[DNA]0(1+E)n[DNA]n=擴(kuò)增產(chǎn)物,[DNA]0=起始濃度,E=擴(kuò)增效率,n=循環(huán)數(shù)Ct值與起始濃度的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)利用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品,按10倍

3、濃度稀釋5個(gè)成梯度,做出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。斜率Ct=-klg[DNA]0+b–斜率=-1/lg(1+e)E=1,斜率=-3.32–擴(kuò)增效率范圍:90%-110%–斜率范圍:-3.1和-3.59之間1.4化學(xué)原理常用熒光標(biāo)記方法:熒光染料法——-SYBRGreenI特定位點(diǎn)探針?lè)ā?TaqMan化學(xué)原理——染料法SYBRGreenI是一種結(jié)合于DNA雙鏈小溝的染料。游離時(shí)不發(fā)光,與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)光。每形成一個(gè)DNA雙鏈,就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上

4、去。所以熒光信號(hào)強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比。1.4.1染料法化學(xué)原理化學(xué)原理——探針?lè)?.4.2探針?lè)ɑ瘜W(xué)原理TaqMan探針是一種寡核苷酸探針。每產(chǎn)生一條DNA鏈,就切斷一條探針,然后產(chǎn)生一個(gè)單位信號(hào),信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比。淬滅基團(tuán)報(bào)告基團(tuán)化學(xué)原理——探針?lè)?.4.2探針?lè)ɑ瘜W(xué)原理探針?lè)ㄅc染料法的優(yōu)缺點(diǎn)1.4.3探針?lè)ê腿玖戏ǖ谋容^幾種定量方法的比較2、幾種定量方法的比較定量方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)電泳成本低。樣品消耗大、操作繁瑣、污染環(huán)境、受人為影響。Agilent2100準(zhǔn)確度高,人為影響小,能檢測(cè)片段大小。成本高,通量小,無(wú)特異性。熒光定量P

5、CR準(zhǔn)確度最高,特異性好。成本高,人為操作影響大,不能檢測(cè)片段大小。幾種定量方法的比較RealtimeQ-PCR在HiSeq2000測(cè)序上的優(yōu)勢(shì)1、原理優(yōu)勢(shì):更適合HiSeq2000的橋式PCR。2、可依據(jù)優(yōu)勢(shì):用以上機(jī)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品,上機(jī)目標(biāo)更明確。3、通量?jī)?yōu)勢(shì):目前CaliperGx一次完成可完成96個(gè)樣品,ViiA7一次最多完成180個(gè)樣品4、穩(wěn)定性?xún)?yōu)勢(shì):從cs的clusters分析,QPCR更穩(wěn)定。定量PCR的實(shí)驗(yàn)流程3、定量PCR的實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)操作:1.稀釋標(biāo)準(zhǔn)品2.稀釋樣品3.配制反應(yīng)預(yù)混液4.加樣5.設(shè)置反應(yīng)程序6.運(yùn)行實(shí)驗(yàn)7.分析數(shù)據(jù)兩種儀

6、器圖片4、StepOnePlus及ViiA7與熒光定量應(yīng)用StepOnePlus?SystemLifeTech-ViiA7VS兩種儀器比較4.1StepOnePlus及ViiA7對(duì)比熒光定量的應(yīng)用4.2熒光定量的應(yīng)用1、DNA或RNA的定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè),轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)等。2、基因表達(dá)差異分析。例如比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等),特定基因在不同時(shí)期的表達(dá)差異以及cDNA芯片的確認(rèn)。3、其它。例如SNP檢測(cè),性別鑒定等。曲線(xiàn)成彎曲的原因5、QPCR定量的常見(jiàn)問(wèn)題5.1擴(kuò)增曲線(xiàn)

7、彎曲原因:樣品濃度跨度太大,有的樣品濃度太高,在同一基線(xiàn)設(shè)置情況下,會(huì)導(dǎo)致Ct值太小(小于基線(xiàn)右側(cè))的樣品的曲線(xiàn)在右側(cè)下跌。解決方案:對(duì)于能檢測(cè)出Ct的樣品,讀出數(shù)據(jù);濃度太高的樣品,需稀釋后另做實(shí)驗(yàn)。曲線(xiàn)成直線(xiàn)的原因5.2直線(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)部分探針降解后,部分reporter從探針上脫落,導(dǎo)致:基線(xiàn)抬高;擴(kuò)增與熒光信號(hào)的增加不一致。結(jié)束課程結(jié)束2014年03月

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