熒光定量PCR簡介.ppt

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1、熒光定量PCR簡介目錄目錄4熒光定量PCR原理123定量PCR的實驗流程幾種定量方法的比較StepOnePlus與ViiA7比較及應用QPCR定量的常見問題5什么是PCR1.1什么是PCR？1、熒光定量PCR原理理想的PCR以2n次方擴增，即：DNAn=DNA0×2nQPCR定義RealtimeQ-PCR通過對PCR擴增反應中每一次循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。1.2QPCR定義1.3數(shù)學原理RealtimeQ-PCR動力學曲線可以分成四個階段：基線階段,指數(shù)增長期、線性增長期和平臺期?；€→閾值→CT值→[DNA]0定量PC

2、R的幾個重要的參數(shù)：基線就是擴增曲線的水平部分。什么是閾值？基線（空白）信號的產(chǎn)生是由于背景引起的。默認閾值=基線（背景）信號標準偏差x10什么是CT值？熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，一般熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。從基線到指數(shù)增長的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)被稱為CT值（ThresholdValue）。PCR擴增的數(shù)學模型擴增產(chǎn)物遵循理論方程：[DNA]n=[DNA]0(1+E)n[DNA]n=擴增產(chǎn)物，[DNA]0=起始濃度，E=擴增效率，n=循環(huán)數(shù)Ct值與起始濃度的關系標準曲線利用已知拷貝數(shù)的標準品，按10倍

3、濃度稀釋5個成梯度，做出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。斜率Ct=-klg[DNA]0+b–斜率=-1/lg(1+e)E=1,斜率=-3.32–擴增效率范圍：90%-110%–斜率范圍：-3.1和-3.59之間1.4化學原理常用熒光標記方法：熒光染料法——-SYBRGreenI特定位點探針法——-TaqMan化學原理——染料法SYBRGreenI是一種結(jié)合于DNA雙鏈小溝的染料。游離時不發(fā)光，與DNA結(jié)合時發(fā)光。每形成一個DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上

4、去。所以熒光信號強度與DNA分子總數(shù)目成正比。1.4.1染料法化學原理化學原理——探針法1.4.2探針法化學原理TaqMan探針是一種寡核苷酸探針。每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針，然后產(chǎn)生一個單位信號，信號強度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比。淬滅基團報告基團化學原理——探針法1.4.2探針法化學原理探針法與染料法的優(yōu)缺點1.4.3探針法和染料法的比較幾種定量方法的比較2、幾種定量方法的比較定量方法優(yōu)點缺點電泳成本低。樣品消耗大、操作繁瑣、污染環(huán)境、受人為影響。Agilent2100準確度高，人為影響小，能檢測片段大小。成本高，通量小，無特異性。熒光定量P

5、CR準確度最高，特異性好。成本高，人為操作影響大，不能檢測片段大小。幾種定量方法的比較RealtimeQ-PCR在HiSeq2000測序上的優(yōu)勢1、原理優(yōu)勢：更適合HiSeq2000的橋式PCR。2、可依據(jù)優(yōu)勢：用以上機的樣品作為標準品，上機目標更明確。3、通量優(yōu)勢：目前CaliperGx一次完成可完成96個樣品，ViiA7一次最多完成180個樣品4、穩(wěn)定性優(yōu)勢：從cs的clusters分析，QPCR更穩(wěn)定。定量PCR的實驗流程3、定量PCR的實驗流程實驗操作：1.稀釋標準品2.稀釋樣品3.配制反應預混液4.加樣5.設置反應程序6.運行實驗7.分析數(shù)據(jù)兩種儀

6、器圖片4、StepOnePlus及ViiA7與熒光定量應用StepOnePlus?SystemLifeTech-ViiA7VS兩種儀器比較4.1StepOnePlus及ViiA7對比熒光定量的應用4.2熒光定量的應用1、DNA或RNA的定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測等。2、基因表達差異分析。例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異（如藥物處理、物理處理、化學處理等），特定基因在不同時期的表達差異以及cDNA芯片的確認。3、其它。例如SNP檢測，性別鑒定等。曲線成彎曲的原因5、QPCR定量的常見問題5.1擴增曲線

7、彎曲原因：樣品濃度跨度太大，有的樣品濃度太高，在同一基線設置情況下，會導致Ct值太?。ㄐ∮诨€右側(cè)）的樣品的曲線在右側(cè)下跌。解決方案：對于能檢測出Ct的樣品，讀出數(shù)據(jù)；濃度太高的樣品，需稀釋后另做實驗。曲線成直線的原因5.2直線擴增曲線部分探針降解后，部分reporter從探針上脫落，導致：基線抬高；擴增與熒光信號的增加不一致。結(jié)束課程結(jié)束2014年03月