實驗一_雞新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗體水平測定法.doc

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1、雞新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗體水平測定法1．本次實驗的目的和要求掌握雞新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗體水平測定法，以便檢查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。2．實驗容或原理?某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能夠與動物的紅細胞發(fā)生凝集，此即為紅細胞凝集現象(HA)。這種紅細胞凝集現象可于病毒懸液中加入特異免疫血清所抑制，即為紅細胞凝集抑制試驗(HI)。3．需用的儀器或試劑等動物健康成雞2-5只，被檢雞15-25只。器材高壓滅菌器、濾紙、試管、試管架、離心機、離心管、三棱針、徑2mm聚乙烯塑料管10

2、0cm、酒精燈、石蠟、96孔V型微量凝集試驗板、0.025mm微量吸液器、微型振蕩器、微量移液器、脫脂棉等。藥劑（1）濃縮抗原；（2）生理鹽水或磷酸緩沖鹽水（PBS）；（3）Alsever細胞保存液；（4）紅細胞懸液；（5）待檢血清4．實驗步驟(1)發(fā)現與鑒定病毒：雞新城疫和禽流感病毒分離后，這些病毒能凝集雞的紅細胞，又能被特異性的已知免疫血清抑制其凝集反應，即可鑒定此病毒。?(2)診斷病毒性疾?。喝缛⊥话l(fā)病的動物早期和恢復期血清進行紅細胞凝集抑制實驗，如抗體效價有4倍以上升高，即有診斷意義。（3）免疫機體抗體效價的

3、測定：?3.雞新城疫（ND）的HA和HI（1）試驗準備?①?抗原：一般以雞新城疫Ⅱ系或LaUra系凍干苗作為已知抗原，進行試驗。?②?0.7％細胞懸浮液：由雞翅靜脈或心臟采血，放入含有抗凝劑的滅菌試管(按每毫升血加入3.8％滅菌檸檬酸鈉0.2毫升做抗凝劑)，迅速混勻。如當時不用，可直接采血放入紅細胞保存液(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱可保存兩周。紅細胞懸液的配制：將血液注入離心管中，經3000轉／分鐘，離心5-10分鐘，用吸管吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜，將沉淀的紅細胞加稀釋液(生理鹽水)洗滌。再用離心機30

4、00轉／分鐘離心5-10分鐘，棄上清，再加稀釋液洗滌，如此反復洗滌三次，將最后一次離心后的紅細胞泥，按0.7％的稀釋度加入稀釋液(0.7毫升紅細胞泥加99.3毫升稀釋液)。?③?被檢血清：將被檢雞群編號登記，用消毒過的干燥注射器采血，注入潔凈干燥試管(微量法可用孔徑2-3毫米塑料管由翅靜脈采血)，在室溫中靜置或離心，待血清析出后使用。每只雞應更換一個注射器，嚴禁交叉使用。④?稀釋液：為滅菌的生理鹽水。⑤?紅細胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，檸檬酸鈉(SHOO)0.80克，檸檬酸(2H20)0.055克，氯化鈉0.

5、42克，蒸餾水加至100毫升。過濾分裝，高壓滅菌10分鐘，放4℃冰箱保存。(2)紅細胞凝集試驗(HA)??主要是測定病毒的紅細胞凝集價，以確定紅細胞凝集抑制試驗所用病毒稀釋倍數(抗原單位)。雞新城疫病毒的HA試驗與HI試驗現采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替試管。①?首先用移液器向每個孔加入稀釋液一滴(0.05毫升)。②?用微量移液器取病毒抗原0.05毫升，加入第一孔，反復抽動6次后，吸出0.05毫升加入第二孔，在第二孔反復抽動6次后，吸出0.05毫升加入第三孔，如此連續(xù)稀釋至第十一孔后吸出0.05毫升棄去。第12孔

6、不加病毒液為紅細胞空白對照。判斷：沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細胞不流動，說明紅細胞被病毒所凝集。如上例：病毒液的HA效價以出現完全凝集的抗原最大稀釋度為準。HI試驗時，病毒抗原液為0.05毫升須含4個凝集單位，則應將原病毒液作成64／4=16倍的稀釋液?？滋枺?23456789101112滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5171:10241:2048對照稀釋液2525252525252525

7、25252525抗原(病毒)2525252525252525252525紅細胞懸液252525252525252525252525作用時間與溫度輕輕振蕩1-2min靜置30-60min結果++++++++++++++++++++﹣﹣﹣﹣﹣注意：+++為完全凝集++為部分凝集—為不凝集(3)紅細胞凝集抑制試驗(HI試驗)：新城疫病毒凝集紅細胞的作用，能被特異性抗體抑制，因此，可用HI試驗(簡稱血凝抑制試驗)測定雞血清中的HI抗體效價(滴度)，并可用標準血清，作新分離病毒的鑒定與未知病毒的診斷。?????微量法：具體操作如

8、下：?①用移液器向每孔加0.05毫升稀釋液，十一孔加0.1毫升。?②用移液器吸取被檢血清(或高免卵黃抗體)0.05毫升注入第一孔，抽放6次后，吸出0.05毫升，注入第二孔，如此連續(xù)稀釋至第10孔，并從第十孔吸出0.05毫升棄去，血清稀釋倍數依次為1：2～1024，11孔和12孔空白。③?每孔再加入已標定好的四單位病毒液0.05毫升