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1、技術(shù)Technique·油脂工程大豆KTi基因和BBi基因雙價(jià)RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建付永平’宋冰’-王丕武’夏海峰·。高瑋a(1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院2．吉林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院3．通化市農(nóng)業(yè)科學(xué)院)【摘要】以KTi基因的ihpRNA種子特異性表達(dá)栽體p7~xP—GUS—KTiS為模板．采用PCR技術(shù)克隆含有KTi基因的完整ihpRNA構(gòu)件，并將其克隆到pMD18一T載體．對(duì)重組子進(jìn)行PCR檢測(cè)和限制性內(nèi)切酶分析，并進(jìn)行序列比對(duì)；然后以BBi基因ihpRNA種子特異性表達(dá)載體p7aP—GFP—BBiS為基礎(chǔ)．利用限制性內(nèi)切酶BstXI單酶切
2、，將KTi基因的完整ihpR2qA構(gòu)件連入其中。最后利用凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，并進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增得到含有KTi基因的完整ihpRNA構(gòu)件．構(gòu)建成重組克隆載體pMD18一T—KRNAi，并構(gòu)建成雙價(jià)ihpRNA種子特異性表達(dá)載體pKTi—BBi—RNAi，并轉(zhuǎn)化得到含有pKTi—BBi—RNAi的農(nóng)桿茵EHA105。成功構(gòu)建同時(shí)具有大豆胰蛋白酶抑制劑KTi基因和BBi基因的雙價(jià)KNAi種子特異性表達(dá)載體，KTi基因和BBi基因的ihpRNA表達(dá)框架成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿茵中?！娟P(guān)鍵詞】大豆；胰蛋白酶抑制劑KTi基因；BBi
3、基因；RNAi表達(dá)栽體；種子特異性啟動(dòng)子中圖分類號(hào)：TS201．2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000—9868(2012)08—0074一O4大豆蛋白酶抑制劑有Kunitz型胰蛋白酶抑制劑酶和胰凝乳蛋白酶在獨(dú)立的反應(yīng)部位產(chǎn)生抑制。胰蛋白(Kunitztrypsininhibitor，KTi)和Bowman—birk型蛋白酶酶抑制劑是大豆品質(zhì)的主要營(yíng)養(yǎng)抑制因子之一。生大豆抑制劑(Bowman—birktrypsininhibitor。BBi)2種，占大抗?fàn)I養(yǎng)作用的4O％是由蛋白酶抑制因子引起的。主要表豆蛋白含量的6％，其中KTi含量為
4、1．4％左右。主要表現(xiàn)在抑制畜禽小腸胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性，降低達(dá)形式為21．5kDa的蛋白質(zhì)，對(duì)胰蛋白酶有專一的抑制其對(duì)飼料蛋白質(zhì)的消化吸收，從而引起畜禽生長(zhǎng)停滯及性；BBi含量為0．6％左右，分子量為8kDa(單子葉植物畜禽胰腺肥大和增生等。因此，創(chuàng)制缺失胰蛋白酶抑制或雙子葉植物)或16kDa(單子葉植物)，同時(shí)對(duì)胰蛋白劑的優(yōu)質(zhì)大豆新種質(zhì)，可有效提高大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和加的色澤脫至Y32．7R3．2，可以達(dá)到二級(jí)油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。(4)其他。脫色后的油樣在密閉放置1d后再測(cè)色(2)色澤改善度。復(fù)合脫色之后的油樣色澤Y40澤，顏色較
5、前一天又有明顯改觀．推測(cè)為草酸的后續(xù)反R4．1B1．2(133．4mm)至草酸脫色之后的色澤Y32．7應(yīng)所致，第3d時(shí)再次測(cè)定顏色不在有改變。推測(cè)后續(xù)反R3．2，改善比較明顯。說明草酸的螯合油中鐵離子、分應(yīng)結(jié)束。解谷維素鈉鹽及強(qiáng)還原作用對(duì)降低高酸值稻米油的色澤參考文獻(xiàn)從理論支撐到實(shí)際應(yīng)用均具有較強(qiáng)的可操作性。(3)因子影響度。草酸脫色工藝中，4個(gè)因子影響[1]張克信．草酸在精煉糠油中作脫色劑[J]．中國(guó)油脂，1982(3)[2]齊玉堂．深色油脂脫色工藝研究[J]．糧食與油脂，2004(7)脫色效果的程度由高到低分別是：草酸加入形式
6、、脫色28-29．溫度、脫色時(shí)間和草酸加入量。此結(jié)果表明：草酸以固[3]董建林，魏冰．高酸值油脂助脫色與酯化脫酸工藝的研究[J]體形式加入好，可摒棄液體加入法：溫度85～100~C為中國(guó)油脂，2000，25(6)：82—83．好，溫度過高會(huì)引起氧化反應(yīng)而使油色回色；脫色的時(shí)間15min已經(jīng)足夠，長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)同樣會(huì)因氧化反應(yīng)的基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(L2010621)加深油色：影響度最小的是草酸用量．試驗(yàn)表明：0．1％收稿日期：2012—03—12的草酸量在脫色冷卻后可觀察少量草酸析出，說明0．1％作者簡(jiǎn)介：
7、肇立春(1966一)，女，遼寧丹東人，碩士，教授，研究方的草酸已經(jīng)微過量．0．05％的草酸量沒有析出現(xiàn)象且油向油脂加工及糧油副產(chǎn)品的綜合利用。通信地址：(110034)沈陽市黃河北大街253號(hào)色改善效果略欠佳。74f蕊豳·2012．08油脂工程·Technique技術(shù)工品質(zhì)。以往在大豆的品質(zhì)改良及抗?fàn)I養(yǎng)抑制因子的研1．2方法究中．多采用常規(guī)的雜交和回交等方法，但由于受到遺1．2．1KTi基因完整ihpRNA構(gòu)件的克隆傳基礎(chǔ)窄育種時(shí)間長(zhǎng)的限制，改良作用有限。利用質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取KTi基因ihpRNA種子RNA干擾是指一些小的雙
8、鏈RNA(double—stranded特異性表達(dá)載體p7otP—GUS—KTiS的質(zhì)粒DNA，以其為模RNA，dsRNA)高效、特異地阻斷體內(nèi)相應(yīng)基因的表達(dá)，板，采用種子特異性啟動(dòng)子7僅P的上游引物PBS和NOS促使mRNA降解，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定
