資源描述：
《文獻閱讀_人造生命》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、日期：2012年10月19日創(chuàng)造由化學合成基因組控制的細菌細胞2010年5月20日，美國科學雜志上有一篇研究論文名為“創(chuàng)造由化學合成基因組控制的細菌細胞”，其內(nèi)容摘要為：克雷格·文特爾私人研究機構(gòu)從基因測序信息數(shù)據(jù)化開始，報道含有1,080,000個堿基對的蕈狀支原體JCVI-syn1.0基因組的繪制、合成和組裝，并且把它移植進一個山羊支原體受體細胞中，創(chuàng)造一個僅僅由（化學）合成的染色體組控制的新的蕈狀支原體細胞。該細胞中，唯一的DNA就是那有計劃合成的DNA序列，包含“水印”序列和其他在構(gòu)建過程中所需
2、的基因刪除、多態(tài)性和變異。背景：作者表示，此前科學界對基因組，尤其是基因組的功能，知之甚少。自從1977年桑格（Sanger）及其同事確定了噬菌體φX174的完整基因密碼，即世上第一個DNA基因組完整測序成功以來，生物基因組的測序成果呈指數(shù)型增長，從而產(chǎn)生了數(shù)不清的基因組信息數(shù)據(jù)。然而，即使一個單細胞系統(tǒng)的基因及其對應生物功能都還沒有搞清楚。因此，作者提出了一個研究思路：在簡單的單細胞生物細菌中，染色體是否已經(jīng)包含正常生命活動所需的全部指令？如果真是這樣的話，能否將計算機中的基因組序列用化學合成的方法得
3、到一個能夠復制的完整基因系統(tǒng)？整個團隊用了15年時間，致力于人工合成DNA大分子和染色體，并用來構(gòu)建一個最小的只是包含必需基因的細胞。他們選用的含有已知生物中最小基因組的單細胞生物——生殖支原體，它的485個編碼蛋白質(zhì)的基因中有超過一百個不是必要的。他們最終得到了“由化學合成基因組控制的細菌細胞”。然而，他們的研究并不是一帆風順的。在當時，人工化學合成只能得到平均6kb大小的DNA片段，如何將這些小片段組裝起來得到DNA大分子呢？他們研究得到一種方法：將化學合成的全部DNA小片段導入酵母菌中利用同源重組
4、拼接成大片段，多次進行最終得到完整的基因組。其中，還需利用大腸桿菌擴增、篩選。然而，將化學合成的基因組移植進受體細胞并成功表達也有不少的障礙。例如，如何完整地從酵母菌中提取出染色體？如何將合成的基因組移植進受體細胞，并且建立一個僅由外來基因組控制的細胞？而且，生殖支原體的生長速率及其緩慢。研究團隊重新選擇了生長比較快的蕈狀支原體作為基因組供體，山羊支原體作為人工合成的基因組受體作進一步研究。盡管克服了上述困難，在移植蕈狀支原體天然DNA的時候，他們成功地得到了完全由蕈狀支原體基因組控制的山羊支原體，但為
5、什么改用化學合成的蕈狀支原體基因組會導致失敗呢？研究繼續(xù)進行，他們最后發(fā)現(xiàn)蕈狀支原體和山羊支原體共用一套“抵御系統(tǒng)”，天然的蕈狀支原體基因組已經(jīng)被甲基化，能夠使該基因組被山羊支原體接受。因此，化學合成且在酵母菌中拼接而成的基因組需經(jīng)過甲基化酶修飾。研究結(jié)果最終證明，在簡單的單細胞細菌中，染色體上有其正常生命活動所需的全部指令信息。主要研究結(jié)果：實驗步驟簡單概括為如下4個方面：1)合成供體的基因組DNA：首先，將蕈狀支原體的全基因組測序，并按照該序列信息將其合成為1078條平均長度為1080bp的DNA片
6、段。這些片段兩兩間具有80bp的部分重疊，所有片段拼接起來構(gòu)成蕈狀支原體的全長基因組。值得注意的是這些合成的片段較天然基因組略有一些改動，包括去除了14個不重要的基因、為阻斷基因而設(shè)計的兩個插入序列、27處單核苷酸多態(tài)性(其中19處在意料之中)以及4條用來區(qū)分于天然序列模本的“水印”標記，這些改動都不影響細胞正常的生命活動。該過程涉及到計算機對合成序列的精密計算。2)合成DNA片段的拼接：將以上合成的1078條DNA片段分別連接到載體，使其能在酵母細胞中通過同源重組拼接起來。于是，平均1080bp的DN
7、A片段，10個一組拼接為大約10kb的片段(109個)，然后將這些連接有目的基因片段的載體從酵母中分離出來，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli中進行擴增，以限制酶篩選出陽性克??；之后再將陽性克隆質(zhì)粒中的這109條10kb左右的片段按同樣的方法每組10個拼接成100kb的片段(11個)；這11條片段最終拼接成完整的總共1077947bp的基因組(由于攜帶太大片段的載體在E.coli中不能穩(wěn)定傳代，因此后兩步拼接中采用多重PCR來篩選陽性克隆)。此過程除了2個銜接反應是在體外用酶處理構(gòu)建，其余所有的片段都是在酵母細胞
8、內(nèi)依靠同源重組拼接而成。3)人工基因組的甲基化修飾：由于供體細胞(蕈狀支原體)和受體細胞(山羊支原體)共用同一套限制酶系統(tǒng)，而天然的供體基因組是經(jīng)甲基化修飾的。因此，拼接完成的基因組DNA還需在體外用甲基化酶(從蕈狀支原體或山羊支原體提取物中純化)進行修飾，以避免受體細胞限制酶系統(tǒng)的阻礙。4)人工基因組移植入受體細胞：將構(gòu)建好的人工合成基因組移植入山羊支原體內(nèi)。細胞經(jīng)過不斷分裂傳代，具有人造基因組的細胞在含抗生素的培養(yǎng)基中篩選出來，同時含有
