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1、羅氏(Roche)公司Tunel試劑盒操作說明書?一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定
2、位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。二、器材與試劑器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑盒含TdT10×、熒光素標(biāo)記的dUTP1×、標(biāo)記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯
3、度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8）或細(xì)胞通透液（0.1%TritonX-100in0.1%sodiumcitrate，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。三、實(shí)驗(yàn)步驟操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細(xì)胞通透→加TUNEL反應(yīng)液→加conve
4、rter-POD→與底物DAB反應(yīng)顯色→光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測）：1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣本的處理4.用ProteinaseK工作液處理組織15-30min在21–37°C（溫度、時(shí)間、濃度均需摸索）或者加細(xì)胞通透液8min；5.PBS漂洗2次；6.制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50μlTdT+450μl熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50μl熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽性對(duì)照組先加入100μl
5、DNase1，反應(yīng)在15~25℃×10min，后面步驟同處理組。7.玻片干后，加50μlTUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加50μl熒光素標(biāo)記的dUTP液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×1h。8.PBS漂洗3次；9.可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長為450~500nm，檢測波長為515~565nm）；10.玻片干后加50μlconverter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30min。11.PBS漂洗3次；12.在組織處加50~100μlDAB底物，反應(yīng)15~25℃×10min；13.PBS
6、漂洗3次；14.拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。15.加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200~500個(gè)細(xì)胞）并拍照。可結(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)處理：①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸（見備注4），干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4℃保存；②適當(dāng)方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組，各組
7、離心收集約1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，使細(xì)胞很好的吸附到載玻片上；③將吸附細(xì)胞的載玻片在4%多聚甲醛（見備注2）中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤將吸附細(xì)胞的載玻片在0.2%的TritonX-100（見備注5）中處理5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的6—15四、注意事項(xiàng)1.進(jìn)行PBS清洗時(shí)，每次清洗5min。2.PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。3.在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或
8、在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失
