黃酮類化合物柚皮苷抑制hacat 細(xì)胞rantes產(chǎn)生的研究論文

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1、黃酮類化合物柚皮苷抑制HaCaT細(xì)胞RANTES產(chǎn)生的研究論文【摘要】目的:分析腫瘤壞死因子α(TNFα)和γ干擾素(IFNγ)是否誘導(dǎo)體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT產(chǎn)生趨化因子RANTES,了解柚皮苷是否影響TNFα和IFNγ對合成RANTES的誘導(dǎo)作用。方法:TNFα和IFNγ刺激培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞,應(yīng)用定量RTPCR方法測定RANTES的mRNA表達(dá),應(yīng)用ELISA方法測定上清液中RANTES。結(jié)果:正常培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞RANTES微弱表達(dá),TNFα和IFNγ刺激使HaCaT細(xì)胞RANTES的mRNA表達(dá)與分泌量顯著增加。柚皮苷0.5,0.25mmo

2、l·L1能抑制TNFα和IFNγ誘導(dǎo)的RANTES分泌。結(jié)論:柚皮苷可抑制TNFα和IFNγ引起的HaCaT細(xì)胞分泌RANTES。【關(guān)鍵詞】柚皮苷;RANTES;HaCaT細(xì)胞趨化因子(Chemokine)是一類誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向特定的組織部位浸潤和聚積的具有趨化和細(xì)胞活化作用的細(xì)胞因子。根據(jù)其成熟蛋白中保守半胱氨酸殘基(C,cysteine)的排列,趨化因子可分為4種類型:CXC型、CC型、C型及CX3C型。受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulateduponactivationnormalTcellexpressedandsecretedfactor,RANT

3、ES)屬于CC家族成員。研究表明,RANTES表達(dá)水平的升高與多種炎性疾病有關(guān)。如關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、銀屑病、遲發(fā)性超敏反應(yīng)、腎小球腎炎、哮喘、炎癥性結(jié)腸炎等。RANTES已經(jīng)作為急慢性炎癥的重要介質(zhì).freela公司)、阿維A;TNFα和INFγ(美國PEPROTECHAsia);DMEM培養(yǎng)基(Gibco);MTT(3(4,5)雙甲基2噻唑(2,5)二苯基溴化四氮唑藍(lán),Sigma公司);TaqDNA聚合酶(北京博大泰克BioDev生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司);引物(上海生物工程有限公司);人RANTES定量ELISA試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司);人表皮角質(zhì)

4、形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株(本室保存)。1.2MTT比色分析按照文獻(xiàn)方法4,在96孔培養(yǎng)板中加HACAT細(xì)胞懸液(1.5×104個細(xì)胞/孔)培養(yǎng)過夜,依次加入含藥的完全培養(yǎng)基,實驗組分別加入不同濃度的柚皮苷,陽性對照藥采用阿維A,藥物濃度見表1,陰性照組用培養(yǎng)液替代藥物,空白組僅加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液,每個濃度做3個復(fù)孔。OD值測定波長為570nm。結(jié)果按下式計算藥物對細(xì)胞生長的抑制率:細(xì)胞生長抑制率%=(1實驗組OD值/對照組OD值)×100%;以藥物的不同濃度對角質(zhì)細(xì)胞生長抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線,從中求出藥物的半數(shù)殺傷濃度IC50。1.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液RANTES含量測定

5、將HaCaT細(xì)胞接種于24孔板中(5×104/孔),加入含刺激因子(TNFα和/或INFγ)的無血清DMEM培養(yǎng)基孵育24h,同時進(jìn)行實驗組研究:不同濃度的柚皮苷以及陽性對照阿維A;每組各設(shè)3個復(fù)孔(見表2)。按照試劑盒內(nèi)說明測定上清液中RANTES的含量。1.4RANTESmRNA表達(dá)測定按上述方法培養(yǎng)并處理細(xì)胞,用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,根據(jù)GenBank/NCBI公布的RANTES全長cDNA序列,設(shè)計RANTES引物。正義鏈為5′CCAGCAGTCGTCTTTGTCA3′,反義鏈為5′ATCTCCAAAGAGTTGATGT3′,擴增片段長度為96bp。

6、內(nèi)參照HGAPDH的引物正義鏈為5′CCTCAAGATCATCAGCAAT3′,反義鏈5′CCATCCACAGTCTTCTGGGT3′,擴增片段長度141bp。首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,在應(yīng)用熒光定量PCR的方法測定RANTESmRNA的表達(dá)。反應(yīng)條件為:94℃2min后進(jìn)行下列循環(huán),94℃20S,56℃20S,72℃30S,80℃20S共45個循環(huán)。HGAPDH復(fù)性溫度為54℃。結(jié)果判定:判讀Ct值(擴增曲線進(jìn)入指數(shù)期時的反應(yīng)循環(huán)數(shù)),mRNA相對定量根據(jù)公式計算:目的基因的相對量=2-△△Ct,△△Ct=CtGI(待測樣品)CtGAPDH(待測樣品)CtGI(校正

7、樣品)CtGAPDH(校正樣品)。2結(jié)果2.1MTT比色分析結(jié)果顯示(Tab.1),表皮細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞對阿維A反應(yīng)敏感,對柚皮苷反應(yīng)不敏感,各濃度組細(xì)胞增殖抑制幾乎不受影響,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。Tab.1柚皮苷對表皮細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞增殖的影響(MTT法)2.2RANTES產(chǎn)生的作用結(jié)果見Tab.2,HaCaT細(xì)胞在用TNFα聯(lián)合INFγ刺激48小時后,上清液所含RANTES的濃度明顯增加,HaCaT細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生了明顯的變化,阿維A在5×10-3mmol·L-1,

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