骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞表型分化的影響因素論文

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1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞表型分化的影響因素論文【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨細(xì)胞影響因素關(guān)節(jié)軟骨在受到創(chuàng)傷后,難以自行修復(fù)。傳統(tǒng)的治療方法如軟骨下骨鉆孔術(shù)、軟骨移植、骨膜或軟骨膜移植、軟骨細(xì)胞移植等因修復(fù)組織以纖維軟骨為主,缺少正常透明軟骨的力學(xué)性能及耐用性,故不能取得滿意效果。而應(yīng)用組織工程方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損卻展示了令人鼓舞的前景。種子細(xì)胞是組織工程化軟骨形成的首要條件。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是來源于骨髓的一群非造血干細(xì)胞,在不同誘導(dǎo)條件下具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能。MSCs因具有易于從骨髓中分離和體外大量

2、擴(kuò)增純化、供區(qū)損傷小、便于自體移植、在適宜的體內(nèi)或體外條件下可分化形成軟骨組織等特點(diǎn)，故被認(rèn)為是軟骨組織工程最有希望的種子細(xì)胞來源之一?，F(xiàn)就影響MSCs向軟骨細(xì)胞表型分化的因素綜述如下。1培養(yǎng)方法目前，絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行MSCs的分離與擴(kuò)增，少數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DMEM/F12、αDMEM進(jìn)行，因?yàn)榈吞菞l件比高糖條件更利于MSCs的增殖［1］。傳代細(xì)胞接種密度多為(3～7)×104/cm2。MSCs向軟骨誘導(dǎo)分化多使用高糖DMED培養(yǎng)基，再添加地塞米松、VitC以及培養(yǎng)基添加物ITS(insulitransferrinsodiumselen

3、itemediasupplement)等構(gòu)成不完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)時(shí)再添加有誘導(dǎo)分化作用的細(xì)胞因子,如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等即可構(gòu)成完全誘導(dǎo)培養(yǎng)基。為模擬胚胎時(shí)期軟骨形成的體內(nèi)環(huán)境，越來越多的試驗(yàn)者傾向于應(yīng)用高密度培養(yǎng)或所謂的微球（pellet）方式來重現(xiàn)胚胎發(fā)育過程中的軟骨前體狀態(tài)。目前認(rèn)為,通過離心處理使MSCs聚集成團(tuán),利于細(xì)胞間的自分泌與旁分泌,更符合軟骨生長的要求。PITTENGER等［2］采用離心沉淀式培養(yǎng)法刺激MSCs向軟骨細(xì)胞分化。首先通過離心使MSCs細(xì)胞形成小的團(tuán)狀沉淀,然后靜置培養(yǎng),10～14d后,細(xì)

4、胞形態(tài)由梭形變?yōu)榉蚀筌浌羌?xì)胞狀,表達(dá)軟骨細(xì)胞的特異分子標(biāo)記物Ⅱ型膠原及胞外基質(zhì)中蛋白聚糖豐富。并且,.freelix(含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸、亞油酸、牛血清清蛋白、丙酮酸、抗壞血酸磷酸鹽),細(xì)胞聚集培養(yǎng)時(shí)加入TGFβ10.5～10ng/L。微球細(xì)胞團(tuán)在37℃體積分?jǐn)?shù)0.05CO2環(huán)境下培養(yǎng),7d時(shí)出現(xiàn)Ⅱ型膠原陽性表達(dá),以后逐漸增強(qiáng)，21d后形成的聚合物完全類似軟骨的形態(tài),甲苯胺藍(lán)染色觀察證實(shí)其具有軟骨基質(zhì)的特征,可檢測(cè)到Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原mRNA表達(dá),而Ⅰ型膠原不表達(dá),說明MSCs形成的是軟骨組織,并且為終末表型的肥大軟骨細(xì)胞。SCs培養(yǎng)液中加入不同濃度

5、的TGFβ1,結(jié)果表明，經(jīng)5ng/LTGFβ1處理的MSCsⅡ型膠原mRNA含量是對(duì)照組的1.7倍,Ⅱ型膠原免疫組化染色區(qū)域和強(qiáng)度與TGFβ1的濃度呈量效增長關(guān)系。在進(jìn)一步的研究中，SCs在含TGFβ的單層培養(yǎng)基及含胰島素樣生長因子(IGFⅠ)的三維纖維條件培養(yǎng)基中的軟骨發(fā)生,結(jié)果顯示，0或5ng/L的TGFβ作用6d后,置于0或100ng/L的IGFⅠ的三維纖維條件培養(yǎng)基中,13d后行Ⅰ、Ⅱ型膠原原位雜交和免疫組化測(cè)定蛋白多糖及DNA含量。開始4d中,TGFβ作用的MSCs明顯增殖,形成細(xì)胞集落,蛋白多糖增加2倍;IGFⅠ作用后,包括蛋白多

6、糖和Ⅱ型膠原mRNA等軟骨細(xì)胞功能指標(biāo)顯著增強(qiáng);TGFβ作用后不經(jīng)IGFⅠ作用的細(xì)胞,軟骨生成指標(biāo)表達(dá)減弱,提示MSCs的分化尚不完全,但兩種因子具有協(xié)同作用。BARRY等［6］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ2和TGFβ3誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化的能力強(qiáng)于TGFβ1,并將聚集培養(yǎng)的MSCs向軟骨細(xì)胞分化的過程分成3個(gè)階段：第1階段為誘導(dǎo)分化前6d,標(biāo)志為纖維調(diào)節(jié)素及軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(P)表達(dá)的上調(diào);第2階段為分化的第7天左右,標(biāo)志為Ⅱ型膠原和軟骨粘連蛋白的表達(dá),同時(shí)硫酸軟骨素逐漸增多;第3階段為接下來的14d,糖胺多糖逐漸累積,最終形成成熟的軟骨細(xì)胞。2

7、.2BMPBMP是TGFβ超家族的成員之一,它具有誘導(dǎo)MSCs轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞的能力，并與其他生長因子存在一定的協(xié)同作用。SEKIYA等［7］用BMP6處理MSCs,發(fā)現(xiàn)BMP6能明顯地促進(jìn)細(xì)胞增殖，擴(kuò)大蛋白多糖的染色范圍；培養(yǎng)1周后即檢測(cè)到Ⅱ型前膠原mRNA。加入500ng/LBMP6,10ng/LTGFβ3,10-7mol/L地塞米松的成軟骨培養(yǎng)液中培養(yǎng),微球的總體積增大,質(zhì)量增加10倍,染色顯示蛋白聚糖合成增加,但無地塞米松或TGFβ3時(shí)效果不明顯；微球的體積和蛋白聚糖染色深度增加，說明在微球培養(yǎng)液中加入BMP6,可增強(qiáng)人MSCs的成

8、軟骨分化能力，且BMP6與TGFβ