豬瘟病毒e2基因的克隆及原核和真核表達載體的構(gòu)建

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1、豬瘟病毒E2基因的克隆及原核和真核表達載體的構(gòu)建70HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicineNo102009豬瘟病毒E2基因的競睡及原核朝真核袁達載體的構(gòu)建黃濤,湯德元,嵇辛勤,曾智勇,徐健,王彬(貴州大學動物科學學院,貴州貴陽550025)中圖分類號:$852.651文獻標識碼:B文章編號:1004—7034(2009)10—0070-03豬瘟(Classicalswinefever,CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的高度接觸性傳染病

2、,嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展.豬瘟病毒全基因組為12.5kb左右的正鏈RNA病毒,編碼多聚蛋白,在分類學地位上為黃病毒科瘟病毒屬.所編碼的豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白為C和包膜糖蛋白Eros,E1,E2.其中Eros,E2是病毒誘導機體產(chǎn)生中和抗體的兩個主要保護性抗原,同時也是病毒吸附進入敏感細胞的必需蛋白.豬瘟E2基因編碼的gp55蛋白是引起動物產(chǎn)生保護性免疫的主要抗原蛋白,與完整豬瘟病毒相比,重組蛋白無感染性,而且具有易產(chǎn)生和易純化等優(yōu)點.研究通過對E2蛋白的體外重組,為豬瘟的預防與控制提供安全高效的基因工程

3、疫苗及配套的診斷抗原打下基礎.1材料豬瘟病料,BI21感受態(tài)細胞,DH5e~,pMD18一T載體,原核表達質(zhì)粒pET一32a(+),真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+).TrizolLS@Reagent試劑盒,SuperScriptm反轉(zhuǎn)錄酶,購自Invitrogen公司;RNaseInhibitor,dNTPs,DTF,DL一2000Marker,PCR試劑盒,TaqDNA聚合酶,限制性內(nèi)切酶,小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒與小量膠回收試劑盒等,均購自寶生物工程(大連)有限公司;pfuDNA聚合酶等,

4、購于默克公司.根據(jù)GenBank報告的豬瘟病毒Alfort株,Brescia株和C一株的cDNA序列,通過比對分析,并用Oligo6.0軟件設計1對特異性引物,在E2基因上游5端設計了BamHI酶切位點,E2基因下游5端設計了Hindm酶切位點,預計擴增片段長度為1137bp.引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,其序列及位置如下:P15一CGGGATCCCGGCTAGCCTGCAAG—GAAGATFAC一3,長2440～2464bp;P25一收稿日期:2009—02—13;修回日期:2009—

5、08—09基金項目:貴州省省長基金項目((2005)184號)作者簡介:黃濤(1981一),男,碩士研究生.通訊作者:湯德元(1964一),男,教授,博士,碩士生導師CCCAAGCTFGACCAGCGGCGAGI'I'G'l'I'C.1GTI'AG一3,長3560～3536bp.2方法2.1E2基因的克隆2.1.1病料的處理與總RNA的提取將采集的豬瘟病料用滅菌PBS研磨,用勻漿器磨細后,加入終濃度為1000IU/mL的雙抗感作過夜;于一20cc反復凍融3次,12000r/min離心5～10mi

6、n;收集細胞懸液250L,按Invitrogen公司的TrlzolLS@Reagent試劑盒操作說明書提取病毒總RNA,在生物安全柜中37C干燥15～20min;加入2LDT1s,7IxLDEPC水,1IALRNaseInhibitor,混勻,65qC溶解5min后,冰浴1min;及時進行RT—PCR,或于一80℃保存(保存時間不能太長),待檢.2.1.2RT—PCR擴增及目的基因的回收和純化對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄.取5×FSBuffer2IxL,dNTPs(10mmolfL)0.5L,Sup

7、erScriptmReverseTranscriptase0.5IxL,RNA酶抑制劑(40U/L)0.25IxL,flit(0.1mol/L)0.5L,下游引物(10mmol/L)1.25L,RNA模板5L(反轉(zhuǎn)錄總體系為1OL)在PCR儀中42℃作用1h.立即進行PCR擴增,取ddH2O36IAL,10×PCRBuffer(25retool/LMgC1,)5ixL,10mmol/LdNTPs1tAL,上,下游引物(10mmol/L)PI,P2各2.5L,RT產(chǎn)物2L和pfuDNA聚合酶1L,

8、構(gòu)成50體系后混勻置于PCR儀上進行循環(huán)擴增.反應條件為94℃2min;94℃30S,52℃30S,72℃1min,共35個循環(huán);7210min.擴增完成后,先取5PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,當結(jié)果與預期條帶一致時再將全部PCR產(chǎn)物電泳后,用清潔的刀片切下含有目的片段的凝膠,按DNA凝膠純化試劑盒說明書進行回收和純化.2.1.3目的DNA片段加A及回收純化反應體系(40txL):回收的DNA30txL,10mmolfLdATP1IAL,TaqDNA聚合酶1IAL,10×TaqBuffer