人類tslc1基因克隆及真核表達載體的構(gòu)建論文

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1、人類TSLC1基因克隆及真核表達載體的構(gòu)建論文李文濤周闖趙永福馬秀現(xiàn)張水軍【摘要】目的：克隆人類TSLC1基因并構(gòu)建其真核表達載體pcDNA3.1(+)/TSLC1.方法：從正常皮膚組織中提取總RNA，采用RTPCR方法擴增TSLC1基因全長cDNA，克隆入pMD18T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)PCR、酶切鑒定均為陽性的克隆，進行核苷酸測序分析，再將TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1(+)載體中構(gòu)建表達載體.結(jié)果：RTPCR擴增后的產(chǎn)物在約1413bp處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，TSLC1基因的cDNA片段被

2、成功插入真核表達載體pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的多克隆位點，經(jīng)鑒定與GenBank收錄的TSLC1cDNA序列一致.結(jié)論：TSLC1基因的cDNA片段被成功克隆.freelorsuppressorinlungcancer1,TSLC1)，翻譯產(chǎn)物是442個氨基酸的跨膜蛋白，該蛋白屬于免疫球蛋白超家族成員之一［1］.TSLC1基因在肺癌、鼻咽癌、前列腺癌和宮頸癌均有不同程度的低表達異常，TSLC1不僅在誘導細胞周期的停滯及細胞凋亡中起重要作用，還在調(diào)節(jié)細胞黏連、遷移等生理功能中發(fā)揮重要作用［2］.TSLC1從發(fā)現(xiàn)至今時間尚短

3、，所以目前國內(nèi)外對TSLC1基因及其表達產(chǎn)物的研究報道不多，國內(nèi)尚未克隆出TSLC1基因.本研究我們克隆出了人TSLC1基因的cDNA片段,其中包含有全長的蛋白編碼區(qū),并將其插入真核表達載體，為后續(xù)將進行TSLC1對腫瘤相關功能的研究奠定基礎.1材料和方法1.1材料皮膚組織來源于本院行包皮環(huán)切術的患者.質(zhì)粒pcDNA3.1(+)（美國Invitrogen公司）；E.coliJM109菌株為本實驗室保存.RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；TRIzol試劑（Invitrogen公司）；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ,

4、NotⅠ,OneStepRNAPCRKit(AMV)，pMD18Tvector,T4DNA連接酶（TaKaRa公司）；MarkerⅢ,Ⅳ,Ⅶ（天為時代公司）；PCR擴增儀(T1,D18Tvectorkit說明書進行連接反應，于16℃條件下連接30min，在4℃條件下連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDTSLC1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)JM109受體菌中，將轉(zhuǎn)化的受體菌涂布在含50mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上并進行藍白篩選，37℃培養(yǎng)16h.從LB培養(yǎng)板上隨機挑取單菌落，接種于氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，

5、從菌液中提取質(zhì)粒進行PCR反應，挑選陽性克隆進行酶切鑒定，自動測序儀測序，用chromas軟件分析測序結(jié)果.1.2.5真核表達載體的構(gòu)建及鑒定分別用測序正確的重組質(zhì)粒和質(zhì)粒pcDNA3.1(+)進行BamHⅠ，NotⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物用8g/L瓊脂糖凝膠電泳，回收約1413bp的TSLC1片段和5400bp的pcDNA3.1(+)片段，將線性化的載體片段與回收的TSLC1片段用T4DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，采用氨芐抗性篩選，挑取陽性克隆擴增并小量提取質(zhì)粒進行PCR、雙酶切和測序鑒定［3］

6、.2結(jié)果2.1總RNA的提取提取的總RNA進行甲醛變性電泳，有2條明顯的電泳條帶，分別對應28S，18S，A260nm/A280nm在1.8～2.0之間，表明獲得的RNA完整無降解，滿足下一步實驗要求.2.2RTPCR利用自行設計的一對引物，通過RTPCR方法從上皮組織中擴增出一條長度約為1413bp的單一條帶,與理論預計的cDNA片段長度一致(圖1).2.3PCR產(chǎn)物的克隆及鑒定將回收的TSLC1擴增片段克隆入pMD18T，轉(zhuǎn)化入JM109受體菌，小提質(zhì)粒，用特異引物進行PCR反應（圖2）.再選取PCR呈現(xiàn)陽性的質(zhì)

7、粒進行BamHⅠ和NotⅠ雙酶切（圖3）.對鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行測序的結(jié)果表明克隆的DNA片段與GenBank收錄的TSLC1cRNA序列(序列號：AY358334)完全一致.2.4真核表達載體的構(gòu)建及鑒定將pMDTSLC1重組質(zhì)粒和pcDNA3.1(+)載體分別進行限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后分別回收約1413bp的TSLC1片段和5400bp的載體片段，將兩者連接重組質(zhì)粒，PCR增出一條長度約為1413bp的單一條帶、雙酶切后電泳可觀察到有約1413bp的TSLC1條帶和5400bp的pcDNA3.1

8、(+)條帶和測序鑒定結(jié)果表明克隆的DNA片段與GenBank收錄的TSLC1序列完全一致(圖4).3討論1998年Murakami等［4］發(fā)現(xiàn)，在79個非小細胞肺癌患者中，有25個患者的染色體在11q23處出現(xiàn)雜合性缺失，推測該處可能為抑癌基因缺失，并分離出一段1600bp的基因片段，轉(zhuǎn)染非小細胞肺癌細