vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的發(fā)展

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1、Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的發(fā)展  商業(yè)化的無血清培養(yǎng)基由最初血清替代物的研究發(fā)展到了化學(xué)界定培養(yǎng)基的研究。目前,無血清培養(yǎng)基的發(fā)展趨勢有兩個方向,一是完全化學(xué)界定培養(yǎng)基;二是不含任何動物組分的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)技術(shù)常用的培養(yǎng)基分類如下。  第一代,不含血清,添加替代血清的生物材料。特點是培養(yǎng)基的蛋白含量高,增加了純化工作的難度和成本?! 〉诙瑹o動物培養(yǎng)基,添加基因工程和重組蛋白或植物蛋白水解物。不含動物源性蛋白衍生物,既可保證產(chǎn)品的安全,又能保障細(xì)胞生長?! 〉谌瑹o蛋白培養(yǎng)基,培養(yǎng)基完全不含蛋白。利于純化分離,培養(yǎng)基相對穩(wěn)定,但應(yīng)用局限.  第四代,化學(xué)鑒

2、定培養(yǎng)基。培養(yǎng)基所含成分都是明確的,有利于細(xì)胞體外培養(yǎng)的代謝研究。無血清、無蛋白、無動物、成分明確的新型培養(yǎng)基是最理想、最安全的通用培養(yǎng)基,在細(xì)胞工程領(lǐng)域大規(guī)模生產(chǎn)病毒性疫苗、重組蛋白等制品方面應(yīng)用廣泛[3-4].  1Vero細(xì)胞在病毒性疫苗中的廣泛應(yīng)用和優(yōu)勢  1.1Vero細(xì)胞的近年來隨著生物技術(shù)的發(fā)展,動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已從簡單的試驗研究拓展到了生物學(xué)研究和商業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域。生物制品如生物基因工程疫苗、病毒性疫苗、醫(yī)學(xué)治療性抗體的研究與生產(chǎn)都用到了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。應(yīng)用最廣泛最安全的動物細(xì)胞基質(zhì)是Vero細(xì)胞。Vero細(xì)胞是世界衛(wèi)生組織(EMI為MEM配方改良型,

3、用HEPES和碳酸氫鈉作為緩沖體系,添加了次黃嘌呤、胸苷、丙酮酸鈉、L谷氨酰胺、微量元素和生長因子的多功能培養(yǎng)基。  低血清培養(yǎng)基的問世和應(yīng)用為無血清系列培養(yǎng)基的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)?! ander等[17]用激素替代牛血清刺激特定細(xì)胞分化生長的工作,開辟了化學(xué)界定無血清培養(yǎng)基的發(fā)展開端。無血清化學(xué)界定培養(yǎng)基的設(shè)計和優(yōu)化是Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵?,F(xiàn)今商業(yè)化的Vero細(xì)胞無血清的配方設(shè)計比較通用的方法是選定一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基,如陳天等[18]推薦利用添加了胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒元素(ITS)的DMEM/HamF-12混合培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過響應(yīng)面設(shè)計法、Plac

4、k-ett-Burman法、多因素多水平正交設(shè)計等實驗方法篩選和確定特殊的補充因子及含量來設(shè)計無血清培養(yǎng)基[17].Vero細(xì)胞無血清設(shè)計常用到的特殊補充因子有生長激素、蛋白類、生長因子、貼壁因子、脂類等?! ?.1.1生長激素和生長因子激素是無血清培養(yǎng)基的必需組分,如胰島素,主要作用是增加細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平,促進葡萄糖、氨基酸利用。除此以外,Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基還需添加糖皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、胰高血糖素等激素。生長因子主要促進細(xì)胞的有絲分裂,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,生長因子都是通過牛血清引入的。Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加的生長因子有表皮生長因子、β-轉(zhuǎn)

5、化生長因子和血小板生長因子。文獻[19]報道,在研發(fā)Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基時添加了100μg/L的表皮生長因子,使Vero細(xì)胞的密度提高了15%.除了人為添加外,細(xì)胞在生長過程中也會釋放一些生長因子促進自身的分裂?! ?.1.2蛋白質(zhì)類在實驗研究中最常用的是牛血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白,白蛋白是低相對分子質(zhì)量組分的載體。白蛋白主要是調(diào)節(jié)滲透壓和保護細(xì)胞免受物理損傷,與維生素、脂類、激素、金屬離子和生長因子結(jié)合,穩(wěn)定和調(diào)節(jié)其在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的活性。目前,無血清培養(yǎng)基的開發(fā)研究主要添加的是重組蛋白和植物水解蛋白[20].轉(zhuǎn)鐵蛋白通常和胰島素、硒元素共同添加,簡稱IT

6、S添加物,是大部分無血清培養(yǎng)基所必需的補充因子。  3.1.3促貼壁因子Vero細(xì)胞是貼附依賴性細(xì)胞系,無血清培養(yǎng)基中必須添加促細(xì)胞貼壁的物質(zhì),使Vero細(xì)胞在培養(yǎng)基質(zhì)表面貼壁鋪展生長。應(yīng)用較廣泛的是纖粘連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白、多聚-L(或-D)賴氨酸和鳥氨酸?! ?.1.4微量元素和脂類除基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方提供的微量元素外,常添加的微量元素是硒元素,主要作用是消除自由基對細(xì)胞的損傷。脂類主要是儲存能源、構(gòu)成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以外,還在信號轉(zhuǎn)運和傳遞中起作用?! ?.2Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的商業(yè)化開發(fā)大多數(shù)無血清培養(yǎng)基的配方設(shè)計都申請了專利,秘而不宣,因此在大多基礎(chǔ)

7、實驗室使用的是商業(yè)化的無血清培養(yǎng)基。Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展推動著無血清培養(yǎng)基的商業(yè)化開發(fā),其質(zhì)量也在不斷提高。商業(yè)化的Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品有MDSS2、ProVERO-1、EX-CELLVero、VP-SFM、Opti-ProSFM、HyCloneSFM4MegaVir等[18].  EX-CELLVero是JRH公司推出的針對高密度培養(yǎng)Vero細(xì)胞的含有重組蛋白和植物水解蛋白的無血清培養(yǎng)基,用其培養(yǎng)的Vero細(xì)胞的最高密度和含血清培養(yǎng)達到的密度相當(dāng)。MDSS2是AxcellBiotechnologies公司生產(chǎn)的Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基,該培養(yǎng)

8、基可以用于

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