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1、孤啡肽對(duì)大鼠腦缺血損傷后細(xì)胞凋亡的影響論文【摘要】目的研究孤啡肽(OFQ)對(duì)腦缺血損傷后細(xì)胞凋亡和谷氨酸受體1(GluR1)表達(dá)的影響。方法成年健康雄性Sprague-Daatereceptor(GluR)aftercerebralischemicinjuryinrats.MethodsFourtyadulthealthymaleSprague-Dalydividedintosham-operationgroup(n=8),ischemiagroup(n=8),OFQ0.1μggroup(n=8),OFQ1.0μggroup(
2、n=8),OFQ10.0μggroup(n=8).Themiddlecerebralarteryocclusionmodelialthreadmethodandinterferedinedbyimmunohistochemicalassay.ResultsThereoperativegroup.ThenumberofneuronalapoptoticcellsandtheexpressionofGluRincreasedfolloicinjury.Aftertreatmentberofneuronalapoptoticcell
3、sandtheexpressionofGluRincreasedsignificantlythanthoseintheischemicgroup.ConclusionOFQcouldenhancetheoxideinjuryinducediabyupregulatingtheexpressionofGluR.KEYSTEAD5報(bào)道，OFQ參與腦血液循環(huán)的調(diào)節(jié)，但是否影響腦梗死尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。由于谷氨酸為腦內(nèi)主要興奮性氨基酸(EAA)的一種，能通過(guò)谷氨酸受體1(GluR1)，產(chǎn)生興奮性毒性作用。生理狀態(tài)下谷氨酸合成、分解、攝取和
4、重吸收是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，這種動(dòng)態(tài)平衡一旦遭到破壞，引起的興奮毒性就可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡或壞死，造成廣泛的腦組織病理性損害。本實(shí)驗(yàn)旨在研究OFQ對(duì)腦缺血再灌注后GluR1表達(dá)的影響，探討其在腦缺血損傷中的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Sprague-Dain，應(yīng)用腦立體定位儀,在大鼠右側(cè)腦室內(nèi)埋入微量注射套管并固定，埋管位置為A0.5mm，R/L1mm，H4.2mm。埋管30min后OFQ0.1μg組、OFQ1.0μg組、OFQ10.0μg組分別經(jīng)內(nèi)套管一次性注射OFQ(美國(guó)RDI公司)10μL，濃
5、度分別為0.01、0.10、1.00g/L。1.4原位TUNEL染色大鼠腦缺血再灌注24h，應(yīng)用40g/L水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，左心室插管，經(jīng)主動(dòng)脈先后灌注生理鹽水和40g/L多聚甲醛，取腦，放入含50g/L蔗糖的40g/L多聚甲醛固定液中4℃過(guò)夜;再置入含300g/L蔗糖-40g/L多聚甲醛的固定液中至組織塊沉底。用德國(guó)徠卡冷凍切片機(jī)行冠狀位冷凍切片，切片厚度30μm，每隔15張切片取1張，貼在經(jīng)多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上晾干。按照DendEndTUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(SantaCruz公司)說(shuō)明書(shū)
6、進(jìn)行操作，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(加1mg/LDNaseⅠ)和陰性對(duì)照(不加探針)。熒光顯微鏡下觀察有無(wú)發(fā)出異硫氰基熒光素(FITC)黃綠色熒光的凋亡細(xì)胞。每只大鼠取4張切片，高倍鏡下(400倍)在皮質(zhì)和紋狀體區(qū)的缺血周邊區(qū)隨機(jī)各取4個(gè)視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，取其均數(shù)。1.5免疫組化染色兔抗鼠GluR抗體購(gòu)自SantaCruz公司，SABC免疫組化試劑盒、DAB染液購(gòu)于武漢博士德生物公司。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)染色步驟操作，光鏡下觀察胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。部分切片不加一抗，使用0.1mol/LPBS代替，不出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。每只大鼠取4張切
7、片，在400倍光鏡下隨機(jī)觀察皮質(zhì)和紋狀體區(qū)的缺血周邊區(qū)各4個(gè)視野，LEICAQmol/L，其主要存在于谷氨酸能神經(jīng)末梢囊泡內(nèi)，末梢去極化興奮時(shí)，通過(guò)Ca2+依賴方式釋放谷氨酸，釋放的谷氨酸作用于其受體。生理情況下，細(xì)胞外谷氨酸濃度約為0.6μmol/L，但病理情況下，當(dāng)細(xì)胞外谷氨酸濃度達(dá)到2~5μmol/L時(shí)，就能引起神經(jīng)元的損傷8。柳耀泉等9報(bào)道，腦缺血早期經(jīng)側(cè)腦室注射痛敏孤啡肽FQ可使感覺(jué)誘發(fā)電位波幅降低、恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)、腦梗死體積增大。因此，對(duì)局灶性腦缺血大鼠，拮抗興奮性氨基酸性毒性以及抑制其受體活性，對(duì)腦缺血損傷具有防治
8、作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠腦缺血損傷后皮質(zhì)和紋狀體區(qū)出現(xiàn)大量的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，伴有GluR1表達(dá)增強(qiáng)。應(yīng)用OFQ后凋亡細(xì)胞較缺血組顯著增多，GluR1表達(dá)較缺血組增強(qiáng)，而且與劑量有關(guān)。這與文獻(xiàn)報(bào)道的輕度腦缺血以細(xì)胞凋亡為主，嚴(yán)重腦缺血以壞死為主的結(jié)論相一致10。提示腦缺血再灌注
