轉(zhuǎn)染noggin基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究論文

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1、轉(zhuǎn)染Noggin基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究論文孫弦周盛年張明麗魏先森劉黎青【摘要】目的構(gòu)建Noggin基因的表達(dá)載體,分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs)，探討轉(zhuǎn)染Noggin基因的BMSCs在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的情況。方法應(yīng)用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增Noggin基因,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建載體pCS2+〔Tα1〕Noggin，分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，借助脂質(zhì)體將Noggin基因轉(zhuǎn)入BMSCs。觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化,利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定分化細(xì)胞是否表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性烯醇化酶(NSE)、微管相關(guān)蛋白2(MAP2)以及膠

2、質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。利用RTPCR方法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物mRNA的表達(dá)。結(jié)果成功構(gòu)建Noggin基因的真核表達(dá)載體并分離培養(yǎng)BMSCs。轉(zhuǎn)染Noggin基因表達(dá)載體后,分化的BMSCs形態(tài)似神經(jīng)細(xì)胞；免疫化學(xué)檢測(cè)到NSE、MAP2特異性標(biāo)志物表達(dá),未檢測(cè)到GFAP表達(dá)；RTPCR測(cè)得神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物GAP43、NCAM、SYN1表達(dá)。結(jié)論從形態(tài)、蛋白、基因水平證實(shí)轉(zhuǎn)染Noggin基因的BMSCs在體外可以分化為具有部分功能的神經(jīng)細(xì)胞?！娟P(guān)鍵詞】骨髓基質(zhì)干細(xì)胞;基因轉(zhuǎn)染;Noggin;分化;神經(jīng)細(xì)胞【Abstract】Objective

3、ToconstructanexpressionvectorofNogginandisolatebonemarroesenchymalstemcells(BMSCs),toexplorethedifferentiationofBMSCstransfectedplifiedbyRTPCR,andthenee.Thechangesofcellshapeicrotubuleassociatedprotein(MAP2)andglialfibrillaryacidicprotein(GFAP)ofdifferentiationcellmunocyto

4、chemistry,andneurocytemarkermRNAeasuredbyRTPCR.ResultsTherebinantpCS2+〔Tα1〕Nogginplasmidorphologies.ItedthatthedifferentiatedcellsexpressedNSE,MAP2butnoGFAPbyimmunocytochemistryandneuralfunctionalgenesNCAM,.freeledinmorphology,proteinandgeneaspects.【Keyarroesenchymalstemce

5、lls;Genetransfection;Noggin;Differentiation;Neurocyte目前臨床治療手段對(duì)于已死亡的神經(jīng)細(xì)胞無再生的方法。目前研究報(bào)道BMSCs在體內(nèi)外可以被化學(xué)物質(zhì)如視黃酸、β巰基乙醇，中藥如黃芩甙、天麻，營養(yǎng)因子腦源性神經(jīng)生長因子（BDNGF）、膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子等〔1～3〕,誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，這為解決神經(jīng)損傷的臨床治療提供了更為廣闊的前景。但是利用胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)誘導(dǎo)蛋白（Noggin）對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究尚屬空白。Noggin在神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和神經(jīng)發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，

6、我們?cè)O(shè)想利用Noggin基因誘導(dǎo)BMSCs在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,并為進(jìn)一步探討神經(jīng)發(fā)育機(jī)制的體外研究打下基礎(chǔ)。1材料與方法1.1動(dòng)物由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雄性2～3月齡D18simpleT為一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體,購自大連寶生物有限公司；真核表達(dá)載體質(zhì)粒pCS2+〔Tα1〕GFP由KennedyKrieger研究所NicholasMarshArmstrong教授惠贈(zèng)。Trizol試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、凝膠回收試劑盒購自上海生物工程公司。限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XbaⅠ,T4DNA連接酶、DNAMarkerDL20

7、00均購自大連寶生物有限公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Promega公司;脂質(zhì)體2000、B27購自Invitrogen公司。DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清購自Hyclone公司,Percoll淋巴細(xì)胞分離液系A(chǔ)mershamBioscience公司。MAP2、NSE、GFAP抗體購自美國NeoMarker公司。SABC免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)公司。TRITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG購自中杉生物技術(shù)公司。RNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購自大連寶生物有限公司。所用引物根據(jù)其GenBank序列自

8、行設(shè)計(jì).freelg人胚胎腦組織,按照試劑盒說明取PCR反應(yīng)產(chǎn)物與pMD18simpleT載體進(jìn)行連接反應(yīng),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受