轉(zhuǎn)染Noggin基因的骨髓基質(zhì)干細胞體外分化為神經(jīng)元樣細胞的研究

《轉(zhuǎn)染Noggin基因的骨髓基質(zhì)干細胞體外分化為神經(jīng)元樣細胞的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、轉(zhuǎn)染Noggin基因的骨髓基質(zhì)干細胞體外分化為神經(jīng)元樣細胞的研究作者：孫弦周盛年張明麗魏先森劉黎青【摘要】目的構(gòu)建Noggin基因的表達載體,分離骨髓基質(zhì)干細胞、膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子等〔1～3〕,誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞，這為解決神經(jīng)損傷的臨床治療提供了更為廣闊的前景。但是利用胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)誘導(dǎo)蛋白對骨髓基質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化的研究尚屬空白。Noggin在神經(jīng)前體細胞的增殖和神經(jīng)發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，我們設(shè)想利用Noggin基因誘導(dǎo)BMSCs在體外分化為神經(jīng)元樣細胞,并為進一步探討神經(jīng)發(fā)育機制的體外研究打下基礎(chǔ)。1材料與方法動物由山東大學(xué)實驗動物中心提供雄性2～3月齡Wistar大鼠,

2、體重(200±10)g。試劑與材料基因表達載體構(gòu)建:根據(jù)人Noggin基因cDNA的全部序列,設(shè)計Noggin基因上游引物為5′CATAAGCTTGCGTGGTTGCATCAC3′,下游引物為5′GGTCTAGATTACTGCACGACGAC23′(由上海生工生物有限公司合成)；載體pMD18simpleT為一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體,購自大連寶生物有限公司；真核表達載體質(zhì)粒pCS+〔Tα1〕GFP由KennedyKrieger研究所NicholasMarshArmstrong教授惠贈。Trizol試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、凝膠回收試劑盒購自上海生物工程公司。限制性內(nèi)

3、切酶HindⅢ、XbaⅠ,T4DNA連接酶、DNAMarkerDLXX均購自大連寶生物有限公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Promega公司;脂質(zhì)體XX、B27購自Invitrogen公司。DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清購自Hyclone公司,Percoll淋巴細胞分離液系A(chǔ)mershamBioscience公司。MAP2、NSE、GFAP抗體購自美國NeoMarker公司。SABC免疫細胞化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)公司。TRITC標記的兔抗山羊IgG購自中杉生物技術(shù)公司。RNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒購自大連寶生物有限公司。所用引物根據(jù)其Gen

4、Bank序列自行設(shè)計，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。方法Noggin基因表達載體構(gòu)建取100mg人胚胎腦組織,按照試劑盒說明取PCR反應(yīng)產(chǎn)物與pMD1simpleT載體進行連接反應(yīng),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，挑取數(shù)個菌落,用HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切鑒定。將新構(gòu)建的pMD18Noggin載體、pCS+〔Tα1〕GFP載體應(yīng)用HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切,回收連接載體和目的基因,TDNA連接酶將其連接。在酶切鑒定后,送上海博亞公司測序。大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)脫頸處死大鼠后，在無菌條件下分離大鼠的股骨和脛骨,暴露骨髓腔,用培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,收集骨髓細胞液,輕輕疊加到密度為

5、的Percoll淋巴細胞分離液上,000r/min離心20min,吸取單核細胞層,PBS洗2遍,按2×106的細胞密度將細胞接種到含有20%胎牛血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,置37℃、5%CO2飽和濕度的細胞孵箱中培養(yǎng)。細胞融合后,胰酶消化傳代,倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染按照說明書進行。在轉(zhuǎn)染前1天按照1×104/ml接種到24孔板內(nèi)。轉(zhuǎn)染前隨機分組如下：試驗組：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCS2+〔Tα1〕Noggin；空質(zhì)粒對照組：混合物中不含有質(zhì)粒；空白對照組：不加任何操作。用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒和脂質(zhì)體,將二者輕輕混勻,室溫下孵育20min后加到培養(yǎng)孔中。h后換成細胞分化培養(yǎng)液

6、。分化細胞形態(tài)學(xué)變化細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。以胞體圓形或錐形,折光性增強,突起形成的細胞記為神經(jīng)元樣細胞。特異性標記物檢測取長有細胞的蓋玻片，用4%多聚甲醛固定1min，3%H2O2封閉10min，5%BSA封閉10min，分別加入抗鼠NSE、MAP2多克隆抗體，4℃過夜。避光進行以下操作：分別加入TRITC標記的兔抗山羊IgG，37℃孵育40min，用熒光封片劑封片，在熒光顯微鏡(NikonE600，日本)下觀察結(jié)果。計算陽性細胞百分比。RTPCR檢測神經(jīng)細胞標記物mRNA表達提取細胞總RNA，以O(shè)ligo(dT)1為引物，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶于42℃逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以c

7、DNA為模板用于PCR擴增目的基因，βactin基因做內(nèi)對照。所用引物根據(jù)其GenBank上所查序列自行設(shè)計(表1)。用PCR儀擴增各基因片段，循環(huán)條件為：℃預(yù)變性min，9℃變性40s，5℃退火40s，7℃延伸1min，共30個循環(huán)；最后7℃延伸min。2%瓊脂糖凝膠電泳，BIOPRINT凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，全自動圖像分析系統(tǒng)計算各目的基因與βactin條帶光密度值。RTPCR檢測過程