紅樹植物鹵蕨內(nèi)生真菌penicillium sp. 0935030中的抗菌活性成分研究論文

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1、紅樹植物鹵蕨內(nèi)生真菌Penicilliumsp.0935030中的抗菌活性成分研究論文崔海濱梅文莉繆承杜林海鵬洪葵戴好富【摘要】為研究紅樹林植物鹵蕨(Acrostichumaureurm)內(nèi)生真菌Penicilliumsp.0935030發(fā)酵物中的抗菌活性成分，采用活性追蹤的方法，用多種色譜技術(shù)對(duì)化合物進(jìn)行分離純化，通過理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)鑒定出7個(gè)化合物，分別為：環(huán)(脯氨酸蘇氨酸)(1)，環(huán)(脯氨酸酪氨酸)(2)，1呋喃基1，2乙二醇(3).freelthefermentationbrothofendophyticfungusPenicilliumsp.09

2、35030frommangroveplantAcrostichumaureurm.Theseparationprocedurenchromatography,andtheirstructuresannitol(5),uridine(6),andliquiritigenin(7)byphysicochemicalandspectraldata.Allpoundsthisfungusforthefirsttime.Antibacterialactivitiesofallthepoundsethod,.freelethicillinresistantStaphylococ

3、cusaureus.KEYRSA)，至今MRSA已成為全球醫(yī)院感染的重要病原菌之一。MRSA具有廣譜耐藥性，其所致感染的治療是臨床十分棘手的難題，尋找有效治療MRSA的新抗生素已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)藥界的重要任務(wù)［4］。本研究組在對(duì)紅樹植物共附生微生物的培養(yǎng)物進(jìn)行生物活性篩選過程中，發(fā)現(xiàn)紅樹林植物鹵蕨(Acrostichumaureurm)內(nèi)生真菌Penicilliumsp.0935030的發(fā)酵液顯示出抗MRSA活性。為了尋找其中的抗菌活性成分，以MRSA、金葡菌和白念珠菌為模型，在活性篩選指導(dǎo)下，從該發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物中分離得到7個(gè)化合物，經(jīng)MS、NMR、1H1HC

4、OSY、HMQC和HMBC等鑒定其結(jié)構(gòu)分別為：環(huán)(脯氨酸蘇氨酸)(1)、環(huán)(脯氨酸酪氨酸)(2)、1呋喃基1，2乙二醇(3)、(3β，4β，22β)12烯3，22，23三羥基齊墩果烷(4)、甘露醇(5)、尿苷(6)和甘草素(7)。以上化合物均為首次從該真菌中分離得到，其中化合物1、2和7具有明顯抗MRSA和金葡菌的活性(Fig.1)。1材料與方法1.1試驗(yàn)試劑和儀器熔點(diǎn)用北京泰克儀器有限公司生產(chǎn)的X5型顯微熔點(diǎn)儀測(cè)定(未校正)。旋光在JASCO20C數(shù)字旋光儀上測(cè)定；MS用VGAutospec3000型質(zhì)譜儀測(cè)定；NMR用Brukerav4

5、00超導(dǎo)核磁儀測(cè)定，以TMS為內(nèi)標(biāo)；薄層層析硅膠和柱層析硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品；SephadexLH20為Merck公司產(chǎn)品；GJ100BE發(fā)酵罐(江蘇鎮(zhèn)江生物儀器公司)；硫酸卡那霉素(上海生工有限公司)，氟康唑(貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)A05031404)，其它試劑均為分析純。供試菌株MRSAATCC9551由英國HeriotRSA和金葡菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［5］：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20g，定容至1L，pH7.0～7.2，121℃滅菌20min；白念珠菌采用YPD培養(yǎng)基［6］：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母粉10g，瓊脂

6、20g，定容至1L，pH7.0，121℃滅菌20min。1.2菌株的分離與培養(yǎng)(1)菌株菌株093503分離自海南文昌清瀾港紅樹林植物鹵蕨(Acrostichumaureurm)的根，植物樣品由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所代正福副研究員鑒定為鹵蕨，菌株093503由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所洪葵教授研究組鑒定為青霉屬，初篩具有抗MRSA活性。菌種保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。(2)培養(yǎng)改良Martin培養(yǎng)基［5］葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，瓊脂20g，50%陳海水定容至1L，pH7.2，12

7、1℃滅菌30min。黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)基［7］可溶性淀粉20g，蛋白胨2g，酵母粉5g，黃豆粉15g，NaCl4g，CaCO34g，50%陳海水定容至1L，pH7.2～7.4，121℃滅菌25min。青霉093503經(jīng)Martin培養(yǎng)基平板活化，接種于黃豆粉種子培養(yǎng)基中，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)3d，按1%接種量接種到70L黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐28℃培養(yǎng)7d。發(fā)酵2批，發(fā)酵液共140L。1.3活性測(cè)試(1)生物活性測(cè)試方法［8］將樣品配成濃度為10mg/ml的溶液，加樣品溶液50μl于直徑6mm的滅菌濾紙圓片上，待溶劑揮干后，將已點(diǎn)樣的濾紙圓