內(nèi)生真菌混合培養(yǎng)及其抗菌活性的初步研究

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1、內(nèi)生真菌混合培養(yǎng)及其抗菌活性的初步研究楊民和蘇經(jīng)遷（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350108）侵染茶樹致病的病原微生物主要是病原真菌。目前世界上已記載的茶樹病害有500多種我國有138種，其中真菌病害72種，線蟲病害9種，寄生性顯花植物園16種，其它病原（類菌原體、細(xì)菌和類細(xì)菌）病害4種，地衣、苔蘚25種，藻類24種，非侵染性10種。針對(duì)茶樹病原菌，目前世界范圍內(nèi)主要使用化學(xué)農(nóng)藥來防治，但是化學(xué)農(nóng)藥的長期使用帶來了許多問題,如昆蟲產(chǎn)生抗藥性并導(dǎo)致農(nóng)藥使用劑量的不斷加大,在糧食、水果、蔬菜中產(chǎn)生殘留,由于生物富集作用而使以這些農(nóng)作物為食物的野生和家養(yǎng)動(dòng)物的殘毒加大。因此,

2、一些國家很早就已經(jīng)開始研制一系列選擇性強(qiáng)、效率高、成本低、不污染環(huán)境和對(duì)人畜無害的生物農(nóng)藥[1]。生物農(nóng)藥如植物內(nèi)生菌生產(chǎn)的抗菌劑、抗蟲劑及生長素對(duì)植物病害起到了很好的防治及促生作用。這樣既減少了化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的影響、又保證了農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。所以植物內(nèi)生真菌的代謝物有的被開發(fā)為農(nóng)作物上用于抗蟲的藥物的潛力，這可能是更安全、更環(huán)保的治療農(nóng)作物病蟲害的潛在的生物資源庫[2]目前，關(guān)于茶樹內(nèi)生真菌的研究工件集中在：（1）針對(duì)單一菌株的分離、鑒定和培養(yǎng)；（2）側(cè)重單一菌株所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。如果把植物內(nèi)生真菌群理解為植物組織內(nèi)的正常菌群，它們不僅包括了互惠共利的和中性的

3、內(nèi)共生微生物，也包括了那些潛伏在內(nèi)的病原微生物。如果將單一菌株分離出來進(jìn)行培養(yǎng)，可能會(huì)由于缺乏其它與之相互作用的微生物的刺激作用而使該單一菌株的代謝活性下降，抗菌物質(zhì)產(chǎn)量降低，甚至無法產(chǎn)生孢子。人類對(duì)微生物的利用，經(jīng)歷過天然混臺(tái)培養(yǎng)到純種培養(yǎng)兩個(gè)階段，分離純培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用是微生物學(xué)發(fā)展的一個(gè)巨大進(jìn)步，但是在長期的實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐中，人們也不斷地發(fā)現(xiàn)很多生物過程是單株微生物不能完成或只能微弱地進(jìn)行，必須依靠兩種或兩種以上的微生物共同培養(yǎng)完成[3]。研究表明：混合培養(yǎng)時(shí)各菌之間可能進(jìn)直接或間接地相互作用，互相提供所需的營養(yǎng)，轉(zhuǎn)移或消除抑制產(chǎn)物，或通過一些物理或生化機(jī)制刺激彼此

4、間的生理活性[4]。隨著內(nèi)生菌純培養(yǎng)技術(shù)的完善和對(duì)內(nèi)生菌間互生和共生現(xiàn)象的研究，進(jìn)行人工的混合菌培養(yǎng)，力求在人工控制的條件下重現(xiàn)幾種內(nèi)生菌在茶樹中的相互關(guān)系，進(jìn)而獲取所需的抗菌物質(zhì)已漸為人們所重視。對(duì)混合菌資源的研究不僅具有深遠(yuǎn)的理論意義，更具有重大的應(yīng)用價(jià)值。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株來源從采自江西廬山植物園、福建省泉州市安溪縣茶園、福建農(nóng)林大學(xué)茶園的茶樹上分離到內(nèi)生真菌。分離方法：取健康茶樹的葉、莖和根部先用自來水將新鮮植物組織表面沖洗干凈，自然晾干后將莖和根切成1cm左右的小段，用75％酒精漂洗1min，無菌水沖洗3～4次，又用3％次氯酸鈉溶液浸泡5min，無

5、菌水沖洗3～4次，每次2min，取最后1次無菌水洗液涂于平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3～4d，若發(fā)現(xiàn)皿中無菌落生成，則證明該材料表面消毒徹底，否則，不能使用。將上述處理過的茶樹材料接種到PDA固體培養(yǎng)基置于28℃溫箱培養(yǎng)5～7d，待各植物組織切面長出菌絲后挑取邊緣部分至試管斜面上，置于28℃溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。1.1.2測試用的病原菌的來源2007年4－5月份從福建農(nóng)林大學(xué)茶園采集出現(xiàn)病害癥狀的茶葉，進(jìn)行茶樹病原菌的分離、鑒定，并獲得多毛孢（茶輪斑?。?、黑腐菌（茶云紋葉枯?。┑募兣囵B(yǎng)。分離方法：選擇典型病斑的茶樹葉片，切下病健交界處組織0.5cm×0.5cm的長段（片），將組織

6、塊先用70%酒精浸5-6秒，后再用0.1％升汞浸泡１分鐘,無菌水洗３次，每次４～５min；組織塊在無菌培養(yǎng)皿中適當(dāng)晾干后，用無菌鑷子（在火焰上燒）移到平板培養(yǎng)基上，在28℃恒溫下培養(yǎng)．1.1.3培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯瓊脂蔗糖培養(yǎng)基）、PD培養(yǎng)基（馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基）。1.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)用菌的選擇在內(nèi)生菌的分離過程中，根據(jù)各種菌內(nèi)PDA平皿上菌落分布及數(shù)量，從中篩選出實(shí)驗(yàn)用菌，作為混合培養(yǎng)篩選的菌種。1.2.2各菌之間相互關(guān)系的初步確定采用兩點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng)法，對(duì)4種菌進(jìn)行活化后，切取培養(yǎng)6天同質(zhì)量的內(nèi)生真菌的菌絲塊接種于PDA平板上距中心2cm處同一直線的兩點(diǎn)上，同時(shí)設(shè)接單

7、種菌為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，于28℃恒溫培養(yǎng)，并觀察兩菌之間的相互關(guān)系。同時(shí)對(duì)能相互混合生長或部分混合生長的用扦片法將蓋玻片插入兩菌之間的邊緣處，并在顯微鏡下觀察，做進(jìn)一步確認(rèn)[5～7]。1.2.3發(fā)酵過程及發(fā)酵液的處理方法由對(duì)峙培養(yǎng)法確定的兩株木霉以1:1的接種量，用0.5cm的打孔器從平板上各取1塊同時(shí)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵。三角瓶的裝液量為總?cè)莘e的2/5，即250ml三角瓶中裝100ml發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，28℃發(fā)酵5d，設(shè)單獨(dú)純種發(fā)酵為對(duì)照。并觀察記錄發(fā)酵過程中菌種形態(tài)與發(fā)