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《葉綠素含量測(cè)定方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)14葉綠素a和b含量的測(cè)定（分光光度法）一、目的學(xué)會(huì)Chla、b含量的測(cè)定方法，了解葉片中Chla、b的含量。二、材料用具及儀器藥品菠菜葉片、721分光光度計(jì)、天平、研缽、剪刀、容量瓶（25ml）、漏斗、濾紙、乙醇（95%）三、原理葉綠素a、b在波長(zhǎng)方面的最大吸收峰位于665nm和649nm，同時(shí)在該波長(zhǎng)時(shí)葉綠素a、b的比吸收系數(shù)K為已知，我們即可以根據(jù)LambertBeer定律，列出濃度C與光密度D之間的關(guān)系式：D665=83.31Ca+18.60Cb…………………………….(1)D649=2
2、4.54Ca+44.24Cb…………………………….(2)(1)(2)式中的D665、D649為葉綠素溶液在波長(zhǎng)665nm和649nm時(shí)的光密度。為葉綠素a、b的濃度、單位為每升克數(shù)。82.04、9.27為葉綠素a、b在、在波長(zhǎng)665nm時(shí)的比吸收系數(shù)。16.75、45.6為葉綠素a、b在、在波長(zhǎng)649nm時(shí)的比吸收系數(shù)。解方程式(1)(2)，則得：CA=13.7D665—5.76D649………………………(3)CB=25.8D649—7.6D665………………………(4)G=CA+CB=6.10D
3、665+20.04D649………(5)此時(shí)，G為總?cè)~綠素濃度，CA、CB為葉綠素a、b濃度，單位為每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以計(jì)算葉綠素a、b及總?cè)~綠素的總含量。四、方法步驟1．稱取0.1克新鮮葉片，剪碎，放在研缽中，加入乙醇10ml共研磨成勻漿，再加5ml乙醇，過濾，最后將濾液用乙醇定容到25ml。2．取一光徑為1cm的比色杯，注入上述的葉綠素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同樣規(guī)格的比色杯中，作為對(duì)照，在721分光光度計(jì)下分別以665nm和649nm波長(zhǎng)測(cè)出該色素液的光密度。計(jì)算結(jié)果
4、：葉綠素a含量（mg/g.FW）=葉綠素b含量（mg/g.FW）=葉綠素總量（mg/g.FW）=五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告計(jì)算所測(cè)植物材料的葉綠素含量。六、思考題測(cè)定葉綠素a、b含量為什么要選用紅光的波長(zhǎng)？3.2葉綠體色素的含量測(cè)定原理根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即：A＝αCL式中：α為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，α為
5、該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。要測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a
6、、b的80％丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長(zhǎng)663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的吸光系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長(zhǎng)645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：A663＝82.04Ca+9.27Cb(1)A645＝16.75Ca+45.60Cb(2)式（1）、（2）中的A645和A663為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663nm和645nm時(shí)的吸光度，Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg·L-1為單位。解方程組(1)、(2)，得：C
7、a＝12.72A663-2.59A645(3)Cb＝22.88A645-4.67A663(4)將Ca與Cb相加即得葉綠素總量CT：CT＝Ca+Cb＝20.29A645+8.05A663(5)另外，由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的吸光系數(shù)(均為34.5)，也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次吸光度(A652)而求出葉綠素a、b總量：CT＝A652×1000/34.5(6)在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時(shí)測(cè)定出溶液中類胡蘿卜素的含量。Lichtenthaler等對(duì)Arnon法進(jìn)行了修
8、正，提出了80％丙酮提取液中三種色素含量的計(jì)算公式：Ca＝12.21A663-2.81A646(7)Cb＝20.13A646-5.03A663(8)Cc＝(1000A470-3.27Ca-104Cb)/229(9)式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cc為類胡蘿卜素的總濃度；A663、A646和A470分別為葉綠體色素提取液在波長(zhǎng)663nm、646nm和470nm下的吸光度。由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公式也有
