細(xì)胞破碎技術(shù)與方法

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1、細(xì)胞破碎技術(shù)與方法?細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)(產(chǎn)品)的基礎(chǔ)。結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進(jìn)展，以前認(rèn)為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。由于細(xì)菌、酵母、真菌、植物都有細(xì)胞壁，但成分不同，且同類細(xì)胞結(jié)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不同，因此其細(xì)胞壁的堅固程度不同，總體呈現(xiàn)遞增態(tài)勢。動物細(xì)胞雖沒有細(xì)胞壁，但具有細(xì)胞膜，也需要一定的細(xì)胞破碎方法來破膜，達(dá)到提取產(chǎn)物的目的。??細(xì)胞破碎的方法主要分為化學(xué)法和機(jī)械法兩大類。具體如下：化學(xué)法滲透沖擊破碎法?方法：滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將

2、細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。反復(fù)凍融法?方法：將細(xì)胞放在低溫下冷凍(約-15℃)，然后在室溫中融化，反覆多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。對于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。酶溶破碎發(fā)法?方法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細(xì)胞壁分解，使細(xì)

3、胞內(nèi)含物釋放出來。有些細(xì)菌對溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。?特點：a)此法適用多種微生物b)具有作用條件溫和c)內(nèi)含物成分不易受到破壞d)細(xì)胞壁損壞的程度可以控制?存在的問題：a)易造成產(chǎn)物抑制作用b)溶酶價格高c)酶溶法通用性差化學(xué)試劑法?方法：某些有機(jī)溶劑(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來。SDS(十二烷基磺酸鈉)是典型的陰離子表面活性劑?特點：提取核酸時，常用此法破碎細(xì)胞。?存在的問題：a)時間長，效率低;b)化學(xué)試劑毒性較強(qiáng)，同時對產(chǎn)物也有毒

4、害作用通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細(xì)胞。方法技術(shù)原理效果成本應(yīng)用化學(xué)法滲透沖擊滲透壓破壞細(xì)胞溫和便宜動物組織均質(zhì)物或細(xì)胞懸液酶消化法細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞破碎溫和昂貴細(xì)菌或酵母增溶法表面活性劑溶解細(xì)胞壁溫和適中動物或植物組織均質(zhì)物，提取DNA脂溶法有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn)適中便宜動物或植物組織均質(zhì)物，提取DNA堿處理法堿的皂化作用使細(xì)胞壁融解劇烈便宜菌液質(zhì)粒DNA提取，RNA提取機(jī)械法組織搗碎機(jī)?方法：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。?特點：一般用于動物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等

5、，轉(zhuǎn)速可高達(dá)10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機(jī)械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。勻漿器?方法：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹脂等。?特點：此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動物臟器組織。?存在的問題：較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌以及有些亞細(xì)胞器，質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥者，不適合用該法處理。研磨?原理：將液氮預(yù)凍的樣本放入研缽內(nèi)研磨?特點：多用于堅硬植物材料，研磨時常

6、加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。超聲波?原理：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，超聲對細(xì)胞的作用主要有熱效應(yīng)，空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。?特點：a)處理少量樣本，操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時間;b)多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎，如用大腸桿菌制備各種酶。?存在問題：a)超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。b)大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。c)對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。高壓勻漿?方法：利用超高壓能量使樣品通過狹縫瞬間釋放，在剪切效應(yīng)、空穴效應(yīng)、碰撞效應(yīng)的作用下，使細(xì)胞破碎。全過程在4~6℃低溫循環(huán)水浴中進(jìn)行，保

7、持原有物質(zhì)活性。?特點：可連續(xù)操作，適合于處理大量樣本，主要用于從微生物樣本中提取蛋白等胞內(nèi)產(chǎn)物。振蕩珠擊破碎?方法：將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中，再加入緩沖液與穩(wěn)定成份到1.5ml的體積，用6500RPM振蕩機(jī)高速上下振動8秒，休息8秒，再振動8秒即可。?特點：此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法。一臺機(jī)器最多可以在一天處理2400支樣品。對小量且多樣的人很方便。方法技術(shù)原理效果成本應(yīng)用機(jī)械法勻漿法細(xì)胞被