細胞破碎技術(shù)與方法

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1、細胞破碎技術(shù)與方法?細胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁，使細胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)(產(chǎn)品)的基礎(chǔ)。結(jié)合重組DNA技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)上的重大進展，以前認為很難獲得的蛋白質(zhì)現(xiàn)在可以大規(guī)模生產(chǎn)。由于細菌、酵母、真菌、植物都有細胞壁，但成分不同，且同類細胞結(jié)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不同，因此其細胞壁的堅固程度不同，總體呈現(xiàn)遞增態(tài)勢。動物細胞雖沒有細胞壁，但具有細胞膜，也需要一定的細胞破碎方法來破膜，達到提取產(chǎn)物的目的。??細胞破碎的方法主要分為化學(xué)法和機械法兩大類。具體如下：化學(xué)法滲

2、透沖擊破碎法?方法：滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的溶液中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，由于滲透壓的作用，細胞內(nèi)水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當(dāng)達到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓毎D(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細胞快速膨脹而破裂。反復(fù)凍融法?方法：將細胞放在低溫下冷凍(約-15℃)，然后在室溫中融化，反覆多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細胞膨脹而破裂。對于細胞壁較脆弱的菌體，可

3、采用此法。酶溶破碎發(fā)法?方法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細胞壁分解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。有些細菌對溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8摩爾尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對溶菌酶敏感而溶解。?特點：a)此法適用多種微生物b)具有作用條件溫和c)內(nèi)含物成分不易受到破壞d)細胞壁損壞的程度可以控制?存在的問題：a)易造成產(chǎn)物抑制作用b)溶酶價格高c)酶溶法通用性差化學(xué)試劑法?方法：某些有機溶劑(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)含物有選擇地

4、滲透出來。SDS(十二烷基磺酸鈉)是典型的陰離子表面活性劑?特點：提取核酸時，常用此法破碎細胞。?存在的問題：a)時間長，效率低;b)化學(xué)試劑毒性較強，同時對產(chǎn)物也有毒害作用通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細胞。方法技術(shù)原理效果成本應(yīng)用化學(xué)法滲透沖擊滲透壓破壞細胞溫和便宜動物組織均質(zhì)物或細胞懸液酶消化法細胞壁被消化，使細胞破碎溫和昂貴細菌或酵母增溶法表面活性劑溶解細胞壁溫和適中動物或植物組織均質(zhì)物，提取DNA脂溶法有機溶劑溶解細胞壁并使之失穩(wěn)適中便宜動物或植物組織均質(zhì)物，提取DNA堿處理法堿的皂化作用使細胞壁融

5、解劇烈便宜菌液質(zhì)粒DNA提取，RNA提取機械法組織搗碎機?方法：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。?特點：一般用于動物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。勻漿器?方法：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。制作勻漿器的材料，除玻璃外，還可以用硬質(zhì)塑料、不銹鋼、人造熒光樹

6、脂等。?特點：此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。?存在的問題：較易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌以及有些亞細胞器，質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥者，不適合用該法處理。研磨?原理：將液氮預(yù)凍的樣本放入研缽內(nèi)研磨?特點：多用于堅硬植物材料，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。超聲波?原理：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，超聲對細胞的作用主要有熱效應(yīng)，空化效應(yīng)和機械效應(yīng)。?特點：a)處理少量樣本，操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時間;b)多用于微生物和組織細胞

7、的破碎，如用大腸桿菌制備各種酶。?存在問題：a)超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。b)大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。c)對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。高壓勻漿?方法：利用超高壓能量使樣品通過狹縫瞬間釋放，在剪切效應(yīng)、空穴效應(yīng)、碰撞效應(yīng)的作用下，使細胞破碎。全過程在4~6℃低溫循環(huán)水浴中進行，保持原有物質(zhì)活性。?特點：可連續(xù)操作，適合于處理大量樣本，主要用于從微生物樣本中提取蛋白等胞內(nèi)產(chǎn)物。振蕩珠擊破碎?方法：將等體積的小量組織樣品與高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋蓋微

8、量管中，再加入緩沖液與穩(wěn)定成份到1.5ml的體積，用6500RPM振蕩機高速上下振動8秒，休息8秒，再振動8秒即可。?特點：此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法。一臺機器最多可以在一天處理2400支樣品。對小量且多樣的人很方便。方法技術(shù)原理效果成本應(yīng)用機械法勻漿法細胞被