整合素β1在小鼠慢性心肌炎中的作用

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1、整合素β1在小鼠慢性心肌炎中的作用：吳輝唐其柱葉明丁家望李書國李莉李松李穩(wěn)慧陳勇楊俊【摘要】目的觀察整合素β1(CD29)在慢性心肌炎小鼠心肌的表達(dá)，探討其在慢性心肌炎中的作用。方法豬心肌肌凝蛋白致Balb/c小鼠自身免疫性心肌炎模型，觀察并記錄免疫小鼠發(fā)病情況，同時用免疫組化SP法檢測CD29在心肌的表達(dá)變化。結(jié)果實驗早期(初次免疫后14、30d)，小鼠心肌淋巴細(xì)胞浸潤較明顯，CD29在心肌的表達(dá)高于正常組(P<0.05);實驗后期(60、120d)，小鼠心肌炎癥細(xì)胞減少，而心臟重量與體重的比值增加顯著，纖維化出現(xiàn)，CD29在心肌的表達(dá)最強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論

2、在小鼠慢性心肌炎的發(fā)展過程中，CD29參與了炎癥反應(yīng)及心肌的纖維化，從而促進(jìn)了心肌炎向心肌病的轉(zhuǎn)化?！娟P(guān)鍵詞】整合素β1;慢性心肌炎;心肌肌球蛋白擴(kuò)張型心肌病(DCM)是導(dǎo)致心力衰竭的常見病因，其病因和發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚,且尚無有效治療手段。近年來自身免疫學(xué)機(jī)制在該病發(fā)病中的作用日益受到重視〔1〕。整合素β1(CD29)是整合素家族中的一員，它在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的增殖、分化，組織的修復(fù)、凋亡及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)上起著重要作用。本研究通過檢測CD29在慢性心肌炎小鼠心肌的表達(dá)情況，探討其在心肌炎及DCM發(fā)生及發(fā)展過程中的作用。　　1材料與方法　　1.1動物近交系Balb/c小鼠

3、(武漢生物制品研究所，雌雄不限)，4周齡，16～20g，按隨機(jī)原則分為實驗組和對照組?！　?.2肌凝蛋白的制備及免疫心肌肌凝蛋白用豬心室肌制備，主要參照文獻(xiàn)〔2〕。將肌凝蛋白溶于0.14mol/L磷酸鉀緩沖液中，終濃度1.0mg/ml,然后與等體積完全弗氏佐劑(Sigma公司)混合研磨成乳濁液，在實驗組小鼠雙側(cè)腹股溝、腋部皮下及足墊皮下注射，每只小鼠注射肌凝蛋白量為1mg。對照組僅用等量的0.14mol/L磷酸鉀緩沖液與等體積完全弗氏佐劑混合液在相同位置注射。免疫時間為第1、7、30天。分別在初次免疫后第14、30、60和120天處死小鼠前，稱取小鼠的體重及心臟重量，并計算二

4、者比值?！　?.3病理檢查心臟離體后，以10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，部分做常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察，余下切片待做免疫組織化學(xué)檢測?！　?.4免疫組化SP法將石蠟切片脫蠟及抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，加3ml/L過氧化氫處理10min;再以PBS沖洗后，依次滴加正常羊血清(室溫30min)，大鼠抗小鼠單克隆抗體(Biolegend公司)(1∶200)(37℃孵育60min,PBS洗)，生物素標(biāo)記的兔抗大鼠IgG(中山公司)(1∶40，37℃孵育30min，PBS洗)，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木素襯染，然后常規(guī)脫水、透明、封片，鏡檢觀察結(jié)果，呈棕黃色者判

5、為陽性。采用HPIAS2000型圖像分析軟件統(tǒng)計陽性率?！　?.5統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗，采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析?！　?結(jié)果　　2.1小鼠心臟重量與體重比值與對照組比較，初次免疫后14d實驗組小鼠心臟重量與體重比值無顯著變化(P>0.05);而在免疫30d后，實驗組小鼠心臟重量與體重比值明顯增加(P<0.05)，見表1。表1兩組小鼠不同時間點心重/體重比較與對照組比較：1)P<0.05，下表同　　2.2病理檢查結(jié)果初次免疫后第14～30天，心肌炎性細(xì)胞浸潤明顯，心肌細(xì)胞間質(zhì)可見到局灶性的炎性細(xì)胞浸潤，主要為淋巴細(xì)胞，

6、心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好。第60～120天，炎癥細(xì)胞減少，纖維化開始出現(xiàn)。對照組中均未見到上述改變(圖1)?！　?.3CD29表達(dá)變化隨著病程進(jìn)展，CD29在心肌的表達(dá)逐漸增多(圖2);與對照組相比，在初次免疫30d以后，實驗組小鼠心肌CD29的表達(dá)顯著增加(P<0.05)，見表2。表2兩組小鼠CD29在心肌的表達(dá)比較　　3討論　　本實驗中，來自于異體(豬)的肌凝蛋白與小鼠自身抗原心肌凝蛋白結(jié)構(gòu)相似，它可激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞而誘發(fā)小鼠自身免疫性心肌炎，即是近年來提出的分子模擬理論〔1〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)用抗體阻止CD29的作用，則能夠阻止遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生，這包括移

7、植物對宿主疾病、抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、半抗原誘導(dǎo)的結(jié)腸炎等〔3～6〕。本實驗中，慢性心肌炎小鼠心肌CD29的表達(dá)隨著心肌炎癥及纖維化的進(jìn)展而逐漸升高，其機(jī)制可能在于：①為炎癥細(xì)胞的募集和保留提供了一種黏附環(huán)境〔7〕;②在以后的過程中作為層黏蛋白、纖維素連接蛋白和玻連蛋白的受體參與對心肌細(xì)胞的固定〔8〕;③像急性心肌炎中高度表達(dá)的細(xì)胞間黏附分子一樣〔9〕，調(diào)節(jié)釋放毒素的免疫效應(yīng)細(xì)胞黏附到表達(dá)CD29的心肌細(xì)胞?！　≡谡纤丶易逯?，CD29還獨特表達(dá)于心肌〔10〕，它可作為心肌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相互作用