質(zhì)粒dna的提取、純化及驗證

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1、質(zhì)粒DNA的提取、純化及驗證姓名：肖風(fēng)學(xué)號：2010001001222010級生物工程一、【實驗?zāi)康摹?、掌握堿變性提取法的原理及各種試劑的作用，掌握堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法。2、掌握質(zhì)粒DNA的純化方法，即用酚、氯仿抽提法除去質(zhì)粒中的蛋白質(zhì)。3、學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進行DNA的分離純化的實驗原理，凝膠的制備及電泳方法及凝膠中DNA的分離純化方法。二、【實驗原理】1、堿變性提取法提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB一氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒DNA

2、的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般實驗室均可進行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細菌細胞以擴增質(zhì)粒；收集和裂解細胞；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細菌細胞中，染色體DNA以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，質(zhì)粒DNA以共價閉合環(huán)狀形式存在。細胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達12．0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補鏈不完全分離。當用pH值4．6的KAc(或NaAc)高鹽溶

3、液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚／氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。2、瓊脂糖凝膠電泳凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分

4、辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(EB)或SYBRGold染色直接觀察到，甚至含量少至20Pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實驗。分子生物學(xué)實驗中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進行電泳。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA片段，進一步純化DNA等。瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶負電荷

5、，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面6個因素：(1)樣品DNA分子的大?。弘娪緯r，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與相對分子質(zhì)量(所含堿基)的對數(shù)值成反比，這是因為大分子有更大的摩擦阻力。(2)DNA分子的構(gòu)象：相對分子質(zhì)量相同而構(gòu)象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA(opencircleDNA，oeDNA)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，

6、就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA(1inerDNA，LDNA)分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀分子。(3)瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃度應(yīng)越低。(4)電泳所用電場：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比，電壓越高，帶電顆粒泳動越快，但隨著電場強度的增加，不同長度DNA泳動的增加程度不同，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升

7、而減少。為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場強度應(yīng)小于5V／cm。(5)緩沖液：緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移率。當電泳液為去離子水(如不慎誤用去離子水配制凝膠)，溶液的導(dǎo)電性很少，帶電顆粒泳動很慢，DNA幾乎不移動；而在高離子強度下(如錯用10×電泳緩沖液)，導(dǎo)電性極高，帶電顆粒泳動很快，產(chǎn)生大量的熱，有時甚至熔化凝膠或使DNA變性。(6)溫度：瓊脂糖凝膠電泳時，不同大小DNA片段的相對電泳遷移率在4～30℃內(nèi)無變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進行，而當瓊脂糖含量少于0．5％時，凝膠很脆弱，最好在4℃下電泳以增加凝膠強度。三、【實驗材料】恒溫振蕩培養(yǎng)箱