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《質(zhì)粒DNA提取純化及驗證.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、.【實驗目的】1、掌握堿變性提取質(zhì)粒DNA法的原理、過程及各種試劑的作用。2、掌握凝膠電泳對DNA分離純化的原理和方法?！緦嶒炘怼?、提取、純化質(zhì)粒DNA（堿變性提取法）提取和純化質(zhì)粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB一氯化銫密度梯度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質(zhì)粒DNA的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般實驗室均可進行。提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測定及分析。堿變性提取質(zhì)粒DNA一般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細菌細胞以擴增質(zhì)粒；收集和裂解細胞
2、；分離和純化質(zhì)粒DNA。在細菌細胞中，染色體DNA以雙螺旋結構存在，質(zhì)粒DNA以共價閉合環(huán)狀形式存在。細胞破碎后，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復性所依賴的溶液pH值不同。在pH值高達12．0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補鏈不完全分離。當用pH值4．6的KAc(或NaAc)高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質(zhì)粒DNA可恢復原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結構而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)一SDS復合物等一起
3、形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚／氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。2、瓊脂糖凝膠電泳..電泳（electrophoresis)是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動
4、。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的速度可因電離子的大小、形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學的核心技術之一。凝膠電泳技術操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍極廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(EB)或SYBRGold染色直接觀察到，甚至含量少至20Pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實
5、驗。分子生物學實驗中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構型和方位進行電泳。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA片段，進一步純化DNA等。瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶負電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面6個因素：1)樣品DNA分子的大?。弘娪緯r，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前遷移的，其遷移速度與相對分子質(zhì)量(所含堿基)的對數(shù)值成反比，這是因為大分子有更大
6、的摩擦阻力。2)DNA分子的構象：相對分子質(zhì)量相同而構象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價閉合環(huán)狀結構的質(zhì)粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA(opencircleDNA，oeDNA)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀DNA(1inerDNA，LDNA)分子。這三種構型的分子有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀分子。3)瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小
7、的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同。通常凝膠濃度越低，則凝膠孔徑越大，DNA電泳遷移速度越快，因此，相對分子質(zhì)量越大，選用的凝膠濃度應越低。4)電泳所用電場：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比，電壓越高，帶電顆粒泳動越快，但隨著電場強度的增加，不同長度DNA泳動的增加程度不同，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減少。為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場強度應小于5V／cm。..5)緩沖液：緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移率。當電泳液為去離子水(如不慎誤用去離子水配制凝膠)，溶液的導電性很少，帶
8、電顆粒泳動很慢，DNA幾乎不移動；而在高離子強度下(如錯用10×電泳緩沖液)，導電性極高，帶電顆粒泳動很快，產(chǎn)生大量的熱，有時甚至熔化凝膠或使DNA變
