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1、牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白fimA基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)和純化（論文關(guān)鍵詞：牙齦卟啉單胞菌 菌毛 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 融合蛋白 固定化金屬螯合親和層析 論文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我國有很高的發(fā)病率，嚴(yán)重影響國民健康水平。慢性牙周炎不僅是導(dǎo)致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，而且還可能是某些系統(tǒng)性疾病的危險因素。慢性牙周炎是一種細(xì)菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（fimbriae）是Pg的重要致病因子，可介導(dǎo)Pg附著于口腔內(nèi)各種組織細(xì)胞的表面，以有利于Pg在體內(nèi)進(jìn)一步的粘附和侵襲；可引發(fā)炎癥反應(yīng)
2、和免疫反應(yīng)。并且菌毛具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答。目前，慢性牙周炎的治療效果還不理想，因此探索預(yù)防慢性牙周炎的有效途徑具有重要意義?！ ⊙芯磕康模罕狙芯繑M在大腸桿菌中表達(dá)FimA蛋白并進(jìn)行蛋白純化。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備抗FimA蛋白的多克隆抗體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！ ⊙芯糠椒ǎ?.以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為宿主菌，用IPTG誘導(dǎo)fimA表達(dá)，通過SDS-PAGE和）（如玻連蛋白和纖維連接蛋白）。人細(xì)胞外基質(zhì)蛋白通過與FimA受體配體的結(jié)合在細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。菌毛對基質(zhì)蛋白有很強(qiáng)的親和力，而且明顯抑制玻連蛋白/纖維連接蛋白與其受體αβ3和配體α
3、5β（在中國倉鼠卵巢CHO細(xì)胞株中過度表達(dá)）的相互結(jié)合。在牙周組織中，菌毛可能通過細(xì)胞外基質(zhì)蛋白受體/配體途徑阻斷細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?！ 【€可介導(dǎo)Pg黏附于牙齦上皮細(xì)胞、牙周袋上皮細(xì)胞、人口腔上皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，附著并凝集人或羊的紅細(xì)胞等。Umemoto[13]構(gòu)建了無菌毛的Pg突變株，發(fā)現(xiàn)其對人口腔上皮癌細(xì)胞的黏附性和侵襲性均降低，接種小鼠后引起牙槽骨喪失的量也減少。其他學(xué)者構(gòu)建了不表達(dá)菌毛的Pg缺陷株，發(fā)現(xiàn)它們黏附和侵襲人牙齦成纖維細(xì)胞[14]、上皮細(xì)胞[15]、內(nèi)皮細(xì)胞[16]和樹突狀細(xì)胞[17]的能力也降低，甚至不能黏附。這些研究結(jié)果
4、說明菌毛在Pg黏附于口腔上皮細(xì)胞的過程中起重要作用?！ 〈送猓芯堪l(fā)現(xiàn)Pg可黏附于唾液覆蓋的羥基磷灰石（hydroxyapatitecoatedA基因后，發(fā)現(xiàn)突變株與sHAP的黏附能力降低。這些研究結(jié)果提示FimA菌毛蛋白在Pg黏附到唾液覆蓋的口腔內(nèi)各種組織表面的過程中起重要作用。 2）在菌斑形成的早期，菌毛可介導(dǎo)Pg黏附于附著在獲得性膜表面的細(xì)菌，間接的附著于組織表面 細(xì)菌之間的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。鏈球菌是最先定植于牙齒表面的主要細(xì)菌，Pg通過菌毛與鏈球菌細(xì)胞表面的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）高親合力、高特異性的結(jié)合而與鏈球菌發(fā)生共聚，這種
5、相互作用在Pg定植于牙周袋的過程中可能起重要作用。此外菌毛還參與Pg與放線菌、福賽氏類桿菌之間的黏附過程?！ ?）有關(guān)黏附機(jī)制的研究 現(xiàn)在已經(jīng)明確Pg黏附于口腔的過程為一種特異性識別過程，菌毛可能為特異性配體，與宿主細(xì)胞膜上的特異性受體相互作用[7]。部分Pg菌毛可識別的黏附受體現(xiàn)已明確，如βintegrins[7,19]、上皮細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白14[20]、巨噬細(xì)胞（MCs）上的TLR2和CD14[7]。菌毛通過上皮細(xì)胞的βintegrins促進(jìn)Pg與牙齦上皮細(xì)胞的黏附，抗βintegrins的抗體能抑制Pg的黏附和侵襲[19]。Pg菌毛通過單核細(xì)胞上的TLR2、CD1
6、4和CD11a/CD18，誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞IL-6mRNA的產(chǎn)生、細(xì)胞因子的分泌、p38促有絲分裂蛋白激酶磷酸化和NF-κB的活化。小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究表明，β2integrins（CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬細(xì)胞與Pg菌毛黏附的細(xì)胞受體；而且β鏈（CD18）在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。 綜上所述，菌毛可介導(dǎo)Pg黏附于齦溝液中的成分（如人血紅蛋白和纖維蛋白原）；人唾液成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG）；乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；宿主細(xì)胞（如牙齦上皮細(xì)胞、牙周袋上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等）；口腔內(nèi)的細(xì)菌（如鏈球菌、放線菌、福賽
7、氏類桿菌）。借助于菌毛黏附于這些物質(zhì)，Pg可在口腔內(nèi)進(jìn)一步定植、侵襲、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生?！ ?.1.2引發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng) Pg附著于口腔內(nèi)組織細(xì)胞后，其抗原成分和毒性產(chǎn)物等可引發(fā)白細(xì)胞的趨化、吞噬等炎癥過程，造成表面組織的損傷——其中Pg菌毛能與脂多糖一起激活宿主的防御機(jī)制、誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生；此外細(xì)菌及其產(chǎn)物還通過上皮細(xì)胞或者細(xì)胞間質(zhì)進(jìn)入表層下組織，在組織內(nèi)繁殖，甚至擴(kuò)散至全身?！ ?）Pg菌毛的白細(xì)胞趨化作用 牙周炎再現(xiàn)了一種重要的中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的破壞宿主組織細(xì)胞的模型。牙周炎的優(yōu)勢病原菌Pg產(chǎn)生的毒力因
