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《牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白fima基因在大腸桿菌中的融合表達和純化（ 》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、牙齦卟啉單胞菌菌毛蛋白fimA基因在大腸桿菌中的融合表達和純化（ 論文關鍵詞：牙齦卟啉單胞菌 菌毛 大腸桿菌表達系統(tǒng) 融合蛋白 固定化金屬螯合親和層析 論文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我國有很高的發(fā)病率，嚴重影響國民健康水平。慢性牙周炎不僅是導致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，而且還可能是某些系統(tǒng)性疾病的危險因素。慢性牙周炎是一種細菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（fimbriae）是Pg的重要致病因子，可介導Pg附著于口腔內(nèi)各種組織細胞的表面，以有利于Pg在體內(nèi)進一步
2、的粘附和侵襲；可引發(fā)炎癥反應和免疫反應。并且菌毛具有良好的免疫原性，可誘導機體的保護性免疫應答。目前，慢性牙周炎的治療效果還不理想，因此探索預防慢性牙周炎的有效途徑具有重要意義。 研究目的：本研究擬在大腸桿菌中表達FimA蛋白并進行蛋白純化。為后續(xù)實驗制備抗FimA蛋白的多克隆抗體提供實驗基礎。 研究方法：1.以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為宿主菌，用IPTG誘導fimA表達，通過SDS-PAGE和mol/L，誘導時間為3h時蛋白表達量最大；當IPTG濃度為1mmol/L，誘導時間為1h時蛋白表達量最小。6×His-FimA表達產(chǎn)物經(jīng)S
3、DS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應位置呈現(xiàn)陽性結果，可見一明顯蛋白條帶，而空質(zhì)粒pET-15b對應位置未見特異條帶。蛋白表達形式分析結果表明表達的融合蛋白位于包涵體中。2.表達產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析，SDS-PAGE上出現(xiàn)一致的單一條帶，其分子量大小與預期相符（約41kDa）。6×His-FimA純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應位置呈現(xiàn)陽性結果，可見一明顯蛋白條帶，條帶位置與BL21(DE3)pLysS全菌誘導表達后相應蛋白位置一致。經(jīng)BCA法蛋白濃度定量試劑盒對純化后的蛋
4、白質(zhì)進行定量分析，計算出純化后的FimA蛋白濃度為0.96mg/ml?！ ≈饕Y論：用本課題組前期構建的fimA基因的原核表達質(zhì)粒pET-15b-fimA，在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中誘導表達后，fimA基因能夠得到正確表達。表達產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析，可以得到帶6×His標簽的FimA融合蛋白?！ ?緒論 慢性牙周炎是導致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，在我國有很高的發(fā)病率，嚴重影響國民健康水平。牙周炎造成的牙周組織的破壞是持續(xù)性的，一旦發(fā)生，目前的治療手段還不能使牙周組織達到完全的恢復。牙周炎還可能是某些系統(tǒng)性疾病的危險因素。隨
5、著我國經(jīng)濟的發(fā)展、人民生活水平的提高和人群壽命的延長，對牙周健康狀況的關注日益提高。因此，探索預防慢性牙周炎的有效途徑對于提高國民健康水平具有重要意義。 疫苗在人和家畜疾病防治方面具有極大的作用，是一種有效的防治疾病的手段。從減毒活疫苗、死疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗到DNA疫苗，由于技術不斷改進，使得疫苗有了廣泛的應用，被成功的用于許多細菌或病毒感染的防治，因此以疫苗來防治牙周炎也已成為一個重要思路?！ ÷匝乐苎资且环N細菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主
6、要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，F(xiàn)imA)是其主要亞單位，能夠介導Pg對宿主組織的粘附與入侵，以及與口內(nèi)其他細菌的粘附共聚[1-3]，還能刺激炎性因子的產(chǎn)生[4]。多菌毛Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而無菌毛的突變菌株則不會造成牙槽骨的破壞。也有實驗發(fā)現(xiàn)，用FimA免疫大鼠可減輕由Pg引起的牙槽骨破壞[5]，將抗FimA的單克隆抗體用于口腔被動免疫，可以抑制該菌在口腔的定植[6]。因此，可以將FimA作為防治牙周炎疫苗抗原?！ g菌毛的單體是FimA，由單拷貝fimA基因編碼。fimA基因全長1290bp，開放讀框包括1
7、044bp，編碼347個氨基酸。翻譯后產(chǎn)物菌毛蛋白的功能域（如刺激T細胞和B細胞的位點、刺激細胞因子產(chǎn)生的位點等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各個位點之間可相互交叉或覆蓋。近年來由于分子生物學和免疫學的發(fā)展，fimA基因已被克隆和測序，對蛋白質(zhì)分子中的各個功能區(qū)、抗原表位已有了更深入的了解，為研制疫苗提供了可靠的依據(jù)?！ 「鶕?jù)國內(nèi)外研究進展，在前期已構建fimA原核表達質(zhì)粒的基礎上，本研究擬在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中表達FimA融合蛋白，并通過金屬螯合親和層析技術進行純化，為后續(xù)實驗制備抗FimA蛋白的多克隆抗體、研發(fā)用于人
8、類的、可有效防治牙周炎的DNA疫苗提供實驗基礎?！ ?文獻回顧 牙周炎是口腔疾病中的常見病和多發(fā)病，在我國有很高的發(fā)病率
