脂肪酶的分離純化

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1、賀州學(xué)院課程考核試卷（論文）（2013—2014學(xué)年第1學(xué)期）課程名稱：酶工程開課單位：化生學(xué)院考核年級(jí)、專業(yè)：11生物工程任課教師：何彩梅論文題目：脂肪酶的分離純化脂肪酶的分離純化摘要：采用簡(jiǎn)單的兩步法—離子交換層析和疏水層析法，對(duì)Candidasp.99?125脂肪酶進(jìn)行了純化，比活提高了10.0倍，達(dá)到27200U/mg，回收率為35.5%.SDS?PAGE電泳分析顯示該酶的分子量約為38kDa.酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH值為8.5，在室溫下具有良好的穩(wěn)定性.鈣離子和Tween80能夠促進(jìn)提高脂肪酶的活性，而鐵離子

2、、銅離子和SDS對(duì)其有明顯的抑制作用.一．前言脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是一類重要的酯鍵水解酶.與動(dòng)植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶的制備周期短，作用pH和作用溫度范圍廣，底物專一性強(qiáng)，便于進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)和制備高純度制劑[1].在眾多脂肪酶中，假絲酵母系(Candidasp.)脂肪酶的用途最為廣泛，特別是用于合成短碳鏈酯類化合物如香料、生物柴油等物質(zhì)[2]和手性化合物的拆分反應(yīng)[3].Candidasp.99-125是本實(shí)驗(yàn)室保存的一類菌種，目前已應(yīng)用于生物柴油[4]、維生素A酯[5]、棕櫚酸異辛酯[6]等物質(zhì)的催化合成研究.然而該菌株生產(chǎn)

3、的脂肪酶中含有大量的雜質(zhì)，不僅影響脂肪酶的酶活水平，而且對(duì)酶促催化反應(yīng)帶來(lái)許多不利因素.為此，本研究采用簡(jiǎn)單的兩步法—離子交換層析和疏水層析法分離純化Candidasp.99-125脂肪酶，并對(duì)純化后酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究.2材料與方法2.1試劑與儀器粗酶粉，產(chǎn)酶菌株為Candidasp.99?125，實(shí)驗(yàn)室自制；聚丙烯酰胺；液相色譜儀；SDS(SodiumDodecylSulfate)電泳儀；DEAESepharoseFF層析柱和PhenylSepharoseFF(Lowsub)層析柱.2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1粗酶液的制備取2g粗酶粉溶于20mLTri

4、s-HCl(20mmol/L,pH=7.5)緩沖液，待攪拌均勻離心，取上清液為上柱用的粗酶液.粗酶液中蛋白的比活為2710U/mg.2.2.2離子交換層析法純化脂肪酶以20mmol/LTris-HCl緩沖液(pH=7.5)平衡離子交換層析柱，上樣4mL粗酶液.先以Tris-HCl緩沖液沖洗掉未被離子交換層析柱結(jié)合的蛋白，再用0~0.4mol/L的NaCl溶液進(jìn)行濃度梯度洗脫，洗脫體積為15倍柱體積，最后以1mol/LNaCl溶液徹底洗脫結(jié)合蛋白.分步收集洗脫液進(jìn)行分析，合并酶活高的組分.2.2.3疏水層析法純化脂肪酶向上節(jié)得到的高活性脂肪酶樣品溶液中

5、加入固體硫酸銨至0.8mol/L，將該溶液注入經(jīng)0.8mol/L硫酸銨(AS)緩沖液(pH=7.0)平衡的疏水層析柱中.先用0.8mol/L硫酸銨緩沖液沖洗掉未被結(jié)合的蛋白，再用0.8~0.0mol/L的硫酸銨緩沖液進(jìn)行濃度梯度洗脫，洗脫體積為10倍柱體積，最后以20mmol/LTris-HCl(pH=7.5)緩沖液繼續(xù)沖洗至徹底洗脫結(jié)合蛋白.分步收集洗脫液進(jìn)行分析.2.2.4脂肪酶活力的測(cè)定脂肪酶活力測(cè)定采用橄欖油乳化液水解滴定法[7].酶活定義：脂肪酶在40℃,pH為8.0的條件下水解橄欖油乳化液產(chǎn)生1μmol/min脂肪酸所消耗的酶量，即為1個(gè)

6、脂肪酶活力單位(記為1U).2.2.5蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用Bradford檢測(cè)法[8].標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為1mg/mL牛血清蛋白(BSA).2.2.6SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳合并2.2.3節(jié)得到的高活性脂肪酶樣品溶液，加入2倍SDS?PAGE上樣緩沖液，經(jīng)沸水浴加熱3～5min，得到電泳樣品.電泳采用濃度為12%的分離膠，控制電壓在150V.電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色.3結(jié)果與討論3.1脂肪酶的純化3.1.1離子交換層析采用DEAESepharoseFF(1mL)作為離子交換層析柱，紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流動(dòng)相流速為0.8m

7、L/min，進(jìn)樣量為4mL.對(duì)上樣后未被DEAE柱結(jié)合的蛋白洗脫液進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果表明，洗脫液中不存在酶活性物質(zhì).然后用NaCl溶液梯度洗脫，結(jié)果如圖1所示.圖1層析柱DEAE分離純化脂肪酶圖1顯示有2個(gè)蛋白吸收峰(A,B)，A峰的峰形與酶活值構(gòu)成的峰吻合，說(shuō)明A峰為純化得到的目標(biāo)脂肪酶蛋白峰，B峰為雜蛋白峰.活性測(cè)定表明，A峰的比活為16600U/mg，純化倍數(shù)為6.1倍，酶收率為55.7%.但2峰之間有牽連現(xiàn)象，無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全分離，說(shuō)明DEAE柱對(duì)Candidasp.脂肪酶的分離效果一般.3.1.2疏水層析采用PhenylSepharoseFF(

8、1mL)作為疏水層析柱.流動(dòng)相流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為4mL.對(duì)上樣后未被Phenyl柱結(jié)合的蛋白