tip30基因抑制人肝癌細胞轉(zhuǎn)移的實驗研究

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1、TIP30基因抑制人肝癌細胞轉(zhuǎn)移的實驗研究福州總醫(yī)院2006年12月第13卷第4期?197??實驗研究?TIP30基因抑制人肝癌細胞轉(zhuǎn)移的實驗研究張霞趙健歐陽學(xué)農(nóng)吳孟超腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性細胞與宿主防御系統(tǒng)問相互作用的最終結(jié)果.這種復(fù)雜的過程包括血管形成【1】,腫瘤細胞從原發(fā)組織脫落,遷移,侵襲細胞外基質(zhì)并進入血管,隨血液循環(huán)至遠處器官,粘附,游出血管,并在靶組織停留,生長【21.關(guān)于肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有許多報道揭示了可能存在的分子機制,包括p53/CDKN2的突變【引,CD44v6E'】的過表達;金屬蛋白酶一9E】和CD24的高表達;染色體8p的缺失等[71都與肝癌的轉(zhuǎn)移有關(guān).但轉(zhuǎn)移并不是一種基

2、因發(fā)生變化而導(dǎo)致的,可能是由多基因構(gòu)成的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果.TIP30/CC~基因首先是在比較高轉(zhuǎn)移性和低轉(zhuǎn)移性小細胞肺癌細胞系時發(fā)現(xiàn)的【引.它能顯著抑制變異性高轉(zhuǎn)移小細胞肺癌(v—SCLC)細胞在SCID—hu—FL(Jk胚肺一聯(lián)合免疫缺陷鼠移植物)動物模型中的轉(zhuǎn)移力.是一種潛在的轉(zhuǎn)移抑制基因.但TItB0基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中的確切作用,參與了哪些過程以及分子機制如何目前不很明確.本課題我們初步探索了TIP30基因?qū)Ω咿D(zhuǎn)移性肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響.并初步探討了其可能存在的分子機制,現(xiàn)做如下報道.l材料與方法1.1主要試劑高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞系HCC-LM3,高糖DMEM培養(yǎng)液(PAAI.L

3、aboratoriesGrabH.Linz.Austria)由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所湯釗猷院士惠贈;TIP30基因,腺病毒載體及其它試劑參見文獻【引.1.2方法1.2.1Westernblot鑒定HCC—LM3細胞中內(nèi)源性和外源性TItB0基因的表達5×10的HCC—LM3細胞接種于6孔培養(yǎng)板.細胞貼壁后分別用30MOI的Ad—TIP30病毒及對照病毒Ad—GFP感染細胞順毒感染方法參見文獻【),48h后提取細胞總蛋白并行westtemablot鑒定TIP30蛋白的表達.1.2.2細胞生長曲線繪制取生長良好的HCC—LM3細胞,2×10'個/孔傳代至24孔培養(yǎng)板.病毒組分別于次日感

4、染30MOI的病毒.置37℃,5%o32孵箱培養(yǎng);病毒感染第2天始用臺盼藍染色記數(shù)細胞,每日計數(shù)4孔,連續(xù)6天,第3天給未消化細作者單位:1.福州總醫(yī)院腫瘤科2.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院胞換液.取平均值繪成生長曲線【9】.1.2.3雙層瓊脂克隆形成實驗取生長良好的HCC—LM3細胞.分別感染30MOI的Ad—TIP30病毒和對照病毒Ad—GFP.參照文獻[10】,將5×10'的細胞接種于含10%胎牛血清,下層濃度為0.53%,上層濃度為0.4%的瓊脂中,孵箱中培養(yǎng)10～14天觀察細胞集落.細胞接種數(shù)每平方厘米不超過35個,6cm平皿中約1000個.1.2.4細胞侵襲力測定實驗【"】按照

5、廠商說明,用10%的冰醋酸溶解染色細胞(每孔加100—200ul的冰醋酸),將染液/溶解物混合物轉(zhuǎn)移至96孔板,酶標(biāo)儀測560rim吸光度值.1.2.5實驗分組及處理將5×10細胞/0.2ml劑量接種裸鼠皮下【,待20只裸鼠皮下腫瘤長至最大直徑約6--8ram時,隨機分為3組:Ad—TItB0組(7只),Ad—GFP病毒對照組(7只)和PBS空白對照組(6只).取100ul滴度為1×10pfu/wa的Ad—TIP30和Ad—GFP病毒.消毒裸鼠肩背部腫瘤處皮膚,將病毒多點注射到瘤體內(nèi).隔天1次.共5次.空白對照組瘤體內(nèi)注射等體積的PBS.每天觀察動物1～2次.注意觀察裸鼠的精神狀態(tài),飲食,

6、腹瀉,測量體重.注射病毒后第3天始每7大1次用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小.1.2.6組織標(biāo)本取材及病理學(xué)檢查皮下接種細胞后6周左右大部分裸鼠出現(xiàn)惡液質(zhì)表現(xiàn)時,脫頸處死裸鼠,剝離皮下腫瘤,用10%福爾馬林固定,同時剖開裸鼠胸腔,從主支氣管離斷并游離出整個肺臟.一半用Boyin液固定以計數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移壯的個數(shù).一半用10%福爾馬林固定作病理學(xué)檢查用.剖開腹腔,觀察肝臟,腹壁,隔肌腹面,腸系膜等各臟器的轉(zhuǎn)移灶并計數(shù),固定后常規(guī)HE染色檢測轉(zhuǎn)移灶[12】.1.3統(tǒng)計學(xué)處理利用statisticalanaly~software(SAS)6.12,t檢驗,卡方檢驗,單因素方差分析.2結(jié)果2.1感染Ad—TIP

7、30后HCC—LM3細胞生長曲線感染病毒后觀察6天,計數(shù)細胞繪制出生長曲線.轉(zhuǎn)入TItB0基因后,HCC—LM3細胞的增殖從第3天始明顯減慢,與對照兩組比細胞數(shù)少(P<0.05),至第6大感染Ad—TIP30病毒的HCC—LM3活細胞數(shù)為對照的70%左?198?右.2.2雙層軟瓊脂克隆形成實驗HCC—LM3細胞感染30MOI的病毒后24h接種于雙層瓊脂中.14天后5X低倍顯微鏡下隨機選擇3個視野計數(shù)克隆數(shù).未感染病