tfpi-2基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞抑制作用的體內(nèi)外實驗研究

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1、重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文TFPI--2基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞抑制作用的體內(nèi)外實驗研究姓名：秦曉林申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗診斷學(xué)指導(dǎo)教師：涂植光；徐勇201205型塑壁塑墮塑喧笪燮邛PI-2對人肝癌細(xì)胞抑制作用的體內(nèi)外實驗研究摘要目的：探討組織因子途徑抑制物2(TFPI．2)基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞H印3B生長增殖、凋亡及甲胎蛋白AFP表達(dá)的影響；以及對H印3B人肝癌細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤生長以及腫瘤血管生成的作用。旆第一階段：將重組質(zhì)粒pcDINA3．1一TFPI一2轉(zhuǎn)染H印3B細(xì)胞并經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)TFPI一2細(xì)胞株，

2、RT-PCR和westemblot檢測轉(zhuǎn)染前后TFPI．2mRNA和蛋白表達(dá)水平；第二階段：體外實驗，采用C吸．8法、繪制細(xì)胞增殖曲線觀察TFPI．2對人肝癌細(xì)胞H印3B生長增殖的影響，通過平板克隆形成實驗觀察單個細(xì)胞的增殖能力，IH-PCR檢測甲胎蛋白(AFP)1nRNA的表達(dá)，并用電化學(xué)發(fā)光法測定培養(yǎng)上清液中AFP含量，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早晚期凋亡情況；第三階段：體內(nèi)實驗，將H印3B穩(wěn)定表達(dá)TFPI．2細(xì)胞株及未轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，待皮下成瘤后，每隔3天測量一次腫瘤大小，并繪制出腫瘤體內(nèi)生長曲線。3

3、周后處死裸鼠，測定腫瘤體積，提取組織中總RNA和蛋白，實時定量qI珂-PCR檢測腫瘤組織TFPI．2和ⅦGFmRNA水平；Westemblot檢測腫瘤組織TFPI．2和ⅥⅪF蛋白表達(dá)量：免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中TFPI．2蛋白表達(dá)量和腫瘤微血管密度(m)。結(jié)果：體外實驗顯示，轉(zhuǎn)染成功的H印3B細(xì)胞檢測到TFPI-2mR_NA翼塑瞪塑墮塑墮笪燮和蛋白的表達(dá)；與轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染ⅡPI．2的細(xì)胞生長增殖能力明顯降低；AFPII承NA表達(dá)抑制率為16．51％，AFP蛋白分泌明顯低于對照組(P

4、式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染TFPI．2的H印3B細(xì)胞早期凋亡率明顯增加(24．03％土7．28％Vs8．77％土3．66％)。移植瘤實驗顯示，H印3B．TFPI．2組最終瘤體大小明顯小于H印3B—V組和Hep3B—P組(P

5、I．2組m計數(shù)明顯低于其余兩組(P

6、FTFPI-20INHUMANHEP筮IDCARC礬OMLACELLS礬VlTRoANDobjective：ToiIlVestigatetheefIfectsoftissuefactorpathwayinhibitor_2

7、(TFPI一2)geneonmepr01iferation，apoptosisa11dexpressionofalphafetoproteinofhepatocarcinomacelllineHep3B．Furmermore，toinVesdgateⅡ1eiIlllibito巧e圩ectsofTFPI一2onthe伊ow吐lmda119iogenesisofhumanh印atocarcinomacenHep3BsubcutaIleousxenograRtumorsiIlnudemiceMethOds：Therecombi

8、nantvectorofpcDNA3．1一TFPI一2wastransfected缸o(hù)Hep3BceⅡs謝thliposome，a11dmeceⅡswereselectedbyG418．TheexpressionsofTFPI一2mRNAandproteiIlweredetectedbyRT．PCRaIldWestemblotrespectively．TheinnuenceofTFPI-2ontheproliferationofHep3Bcells訪agrowthcurVewasassayedbyCCK-8method．

9、Thecolony-fo衄ing眥itassay、VasusedtomeasuresiIlglecenself-replicationability．TheexpressionofAFPmRNAwasdetectedbyRT．PCRandtheAFPsecretionofHep3Bcellwasmeasuredbye