鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)論文

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1、鴨乙型肝炎病毒全基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)論文胡權(quán),張正茂,張小勇,張振華,雷延昌,周敦金,黃建國,楊東亮【摘要】目的構(gòu)建鴨乙型肝炎病毒(DHBV)感染性克隆,通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染獲得單一來源、基因序列清楚的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的感染毒種。方法以湖北麻鴨DHBV分離株(DQ276978)為模板,用PCR法從該DHBV全基因組克隆質(zhì)粒(pMD-DHBV)和DHBV陽性血清中獲取3部分基因片段,總長44kb,克隆至載體PCR21的SacI和NotI酶切位點(diǎn),構(gòu)建含15倍鴨乙型肝炎病毒全基因的重組質(zhì)粒,并酶切鑒定其插入方向。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體LipofectineTM200

2、0導(dǎo)入雞肝癌細(xì)胞系(LMH)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá),收集純化后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染的標(biāo)準(zhǔn)毒種。結(jié)果PCR鑒定、酶切鑒定及序列測定.freelRNA編輯酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞,通過抑制實(shí)驗(yàn)以證實(shí)該DHBV體外實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷某醪綉?yīng)用。1材料與方法11材料111質(zhì)粒pMD-DHBV為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有湖北麻鴨(DQ276978)DHBVDNA全長基因組的質(zhì)粒;pSP65-DHBV16為雙拷貝頭尾相接的全基因DHBVDNA重組質(zhì)粒,該克隆質(zhì)粒(美國Mandart教授饋贈(zèng));APOBEC3G真核表達(dá)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存

3、;PCR21載體(美國Invitrogen公司)。112DHBV陽性血清取自擴(kuò)增出DHBVDNA全長基因組(DQ276978)的陽性血清。113細(xì)胞禽類雞肝癌細(xì)胞系LMH,為本室傳代保存。114工具酶LATaq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、SacI、KpnI、NotI及凝膠回收試劑盒(大連TAKARA公司);TaqDNA聚合酶(美國Promega公司);T4DNA連接酶(美國GIBICO公司)。115生化及其它試劑地高辛(DIG)標(biāo)記及檢測試劑盒(德國Roche公司);2000(美國Invitrogen公司)。DNA凝膠回收試劑盒、

4、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(德國QIAGEN公司);質(zhì)粒提取試劑盒和動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA純化試劑盒(大連TaKR公司)。12方法通過對湖北麻鴨(DQ276978)DHBVDNA的全長克隆質(zhì)粒的序列限制酶切圖譜分析〔1〕,已明確其基因組的結(jié)構(gòu)及與復(fù)制相關(guān)的重要元件的序列位置,在此基礎(chǔ)上運(yùn)用3片法構(gòu)建出能自我復(fù)制的重組質(zhì)粒。121構(gòu)建質(zhì)粒PCR21-DHBV15用EcoRI和BamHI雙酶切pMD-DHBV,得到目的片段DA(DHBV3024/0nt-1473nt);設(shè)計(jì)引物DB1/DB2和DC1/DC2分別經(jīng)PCR擴(kuò)增DHBV陽性血清獲得目的片段DB(1

5、473nt-2870nt)和DC(1395-3024/0nt)。將上述3片段插入PCR21的相應(yīng)酶切位點(diǎn)后即得到15倍DHBV全基因重組質(zhì)粒PCR21-DHBV15。122PCR鑒定引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2為DHBV基因S區(qū)和C區(qū)的高度保守序列段,引物序列如下:Ps1(1318F)5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3′,Ps2(1739R)5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′;Pc1(187F)5′-GCAATCACTAGACCAATCCA-3′,Pc2(397R)5′-GAGATCTATGGTGGCTGCT

6、C-3′。PCR反應(yīng)液組成:10×Buffer5μl;MgCl2(25mmol/L)3μl;dNTP(10mmol/L)1μl;Ps1/Ps2或Pc1/Pc2各1μl;Taq酶1μl;DHBV模板5μl;加滅菌純水至50μl。PCR循環(huán)參數(shù):94℃5min;94℃50s,61℃45s,72℃50s,40個(gè)循環(huán);72℃10min。123酶切鑒定用BamHI,SacI和EcoRI,NotI和EcoRI,SacI和BamHI分別進(jìn)行酶切鑒定。124序列測定取一株陽性克隆質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司測序。125脂質(zhì)體LipofectineTM2000介導(dǎo)

7、的DNA轉(zhuǎn)染在LMH細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,設(shè)未轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞對照和pSP65-DHBV16質(zhì)粒對照。126蛋白印跡(SouthernBlot)分析提取轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞內(nèi)總DNA后,用DIG標(biāo)記的DHBV全長基因組探針雜交,X-ray膠片發(fā)光顯影。127轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中病毒顆粒電鏡觀察收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液,離心后用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解沉淀,將該沉淀溶解物通過磷鎢酸負(fù)染法進(jìn)行電鏡觀察。128APOBEC3G真核表達(dá)質(zhì)粒對DHBV的抑制效應(yīng)實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒PCR21-DHBV15分別與不同劑量(20和40μg)的APOBEC3G真核表達(dá)質(zhì)

8、粒pXF3G-HA通過Lipofect

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