聲波刺激對擬南芥基因表達的影h向

《聲波刺激對擬南芥基因表達的影h向》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、2005年11月重慶大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)NOV．20O5第28卷第11期JournalofChongqingUniversity(NaturalScienceEdition)V01．28No．11文章編號：1000—582X(2005)11—0138—04聲波刺激對擬南芥基因表達的影H向王伯初，張進，段傳人，王道紅(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物力學(xué)與組織工程教育部重點實驗室，重慶400030)摘要：運用銀染mRNA逆轉(zhuǎn)錄差異顯示(DDRT—PCR)技術(shù)，初步研究了聲波刺激對擬南芥差異基因表達的影響．研究分離得到SA3、SG2—1、SG2

2、—2、SG7—1、SG7—2、CA2共6個差異表達基因片段，進一步運用Northern點雜交確定SA3、CA2、SG7—1為陽性片段，其中SA3片段屬于聲波刺激特異表達基因，SG7—1片段屬于聲波刺激增強表達基因，CA2片段屬于聲波刺激抑制表達基因．研究結(jié)果表明植物在基因水平對聲波刺激具有響應(yīng)，為下一步探索植物響應(yīng)聲波應(yīng)力的分子生物學(xué)調(diào)控機理奠定了基礎(chǔ)．關(guān)鍵詞：聲波刺激；擬南芥；差異顯示中圖分類號：Q68文獻標(biāo)識碼：A由Liang等¨于1992年首次建立的mRNA差異組中加入1．26gRNA樣品，然后加入錨定引物，錨顯示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

3、技術(shù)(mRNAdifferentialdisplay定引物和樣品的總體積達到l1，不足l1L時加PCR，DD—PCR)是目前在篩選、克隆差異表達基因方入DEPC處理水補足．于70℃育溫混合物5min，在冰上面廣為應(yīng)用的技術(shù)．該方法通常采用測序膠放射自顯冷卻，加入：4，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液；2，10mmol／L4×影來顯示擴增條帶，雖然有敏感性高的優(yōu)點，但是易造dNTP；20mmol／(rain·L)，RNase抑制劑；加DEPC水成放射性同位素污染，且實驗周期長，對實驗條件要求定容至19L．在37oC育溫5rain，加1L，2．0×也較高

4、j．銀染方法的建立，始于1979年對蛋白質(zhì)的10mol／(min·)的MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混合后在染色【3j，以后逐漸應(yīng)用于核酸．在筆者的研究中，采用42℃育溫60rain，加熱至7O℃并維持10rain停止反銀染mRNA差示顯示分析了聲波刺激后的擬南芥，并應(yīng)，然后于冰上冷卻．獲得了3個陽性片段．1．2．3PCR在PCR擴增中所選用的錨定引物和逆轉(zhuǎn)錄中的1材料與方法錨定引物相同，隨機引物設(shè)計為：HAP1，AAGCTFGAT-1．1材料11GCC；HAP2，AAGCTTCGACT(；HAP3，AA(TIT—將擬南芥分為聲波刺激組和對照組

5、，聲波刺激的GGTCGA；HAP4，AAGCTI'CTCAACG；HAP5，AAGCT_聲強為100dB，頻率為1000Hz．對刺激組刺激9d，每TAGTAGGC；HAP6，AAGCTrCGACCAT；HAP'／，天刺激60rain，實驗組接受刺激時，對照組也拿出培養(yǎng)AAGCTI'AACGAGG；HAP8．AAGCTITrACCGC．箱，放置在與實驗組條件一致的環(huán)境中．按照每個錨定引物和8個隨機引物配對，每個樣1．2方法品用3個錨定引物，則共有24個引物對．在PCR擴增1．2．1總RNA的提取中所選用的錨定引物和逆轉(zhuǎn)錄中的錨定引物相同

6、．采用RNeasyPlantMini試劑盒提取刺激組和對照1．2．4電泳組的總RNA．采用Bio—Rad的電泳槽和電泳儀，進行6％變性1．2．2逆轉(zhuǎn)錄丙烯酰胺凝膠電泳．取3．5IxLPCR產(chǎn)物與2甲酰在本次實驗中，根據(jù)文獻[4]合成3種錨定引物，胺上樣緩沖液混合，置8O℃孵育2rain，將樣品加入oligo—d(T)10M(M=G，A，C)．在每管刺激組和對照6％變性聚丙烯酰胺凝膠上，恒定電壓45V電泳約·收稿日期：2005—07—08基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(30470431)作者簡介：王伯初(1962一)，男，江蘇宜興人

7、，重慶大學(xué)教授，博士，從事植物生物力學(xué)工程和生物制藥工程研究．第28卷第l1期王伯初，等：聲波刺激對擬南芥基因表達的影響1393．5—4h．加樣前先將凝膠加樣孔中的尿素用加樣器2．2銀染結(jié)果沖干凈，以利于得到高分辨率的差異顯示eDNA片段．電泳完畢后，用銀染法檢測不同材料基因轉(zhuǎn)錄水1．2．5銀染平上的差異，根據(jù)差異片段的大小和重復(fù)性結(jié)果筆者參考Carlos和Brant的方法對硝酸銀染色方選取了6條條帶，結(jié)果見圖2．片段SA3的大小為法進行改進．銀染步驟：1)固定，加人100mL固定溶270bp，片段CA2的大小為370bp，片段SG2

8、—1的大液(10％乙醇，1％醋酸)，輕輕搖動10min．2)漂洗，用小為300bp，片段SG2—2的大小為190bp，片段蒸餾水洗膠1rain．3)預(yù)處理，用100mL1．5％的硝酸SG7—1的大小為580bp，片段SG