非生物脅迫對(duì)擬南芥iqm4基因表達(dá)的影響

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1、非生物脅迫對(duì)擬南芥IQM4基因表達(dá)的影響　　【摘要】本文首先以擬南芥IQM4基因?yàn)樗阉鲗?duì)象，檢索了兩個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索到IQM4基因?qū)追N非生物脅迫均能產(chǎn)生應(yīng)答，并對(duì)IQM4基因表達(dá)量進(jìn)行了分析；然后參考數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的實(shí)驗(yàn)方法，采用半定量RT-RCR技術(shù)驗(yàn)證了幾種非生物脅迫對(duì)IQM4基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明鹽和滲透脅迫均能抑制幼苗期IQM4基因表達(dá)，而脫水、低溫和機(jī)械損傷早期能增強(qiáng)IQM4基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)初步證明擬南芥IQM4基因在植物非生物脅迫中發(fā)揮重要作用?！　　娟P(guān)鍵詞】擬南芥；IQM4；非生物脅迫；基因表達(dá)　　在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Ca2

2、+作為動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，通過(guò)Ca2+傳感蛋白及其靶蛋白來(lái)調(diào)節(jié)多種生化和細(xì)胞反應(yīng)。鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM）是目前最重要的一類胞內(nèi)Ca2+信號(hào)受體。在眾多的CaMs中，除CaM7具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性外，其它均無(wú)任何酶活性，必需與其下游的靶蛋白―鈣調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin-bindingprotein，CaMBP）來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能[1]?！　≈参镏杏?個(gè)含IQ基序的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白家族：IQM、Myosin、CNGC、IQD和CAMTA，其中IQM家族由我們發(fā)現(xiàn)[2]。擬南芥IQM家族共有6個(gè)成員，均含1個(gè)IQ基序，N-端具有

3、與豌豆重金屬誘導(dǎo)蛋白6A的同源序列，C-端具有與天花粉素的同源序列。IQM1編碼1個(gè)Ca2+不依賴型的CaMBP，影響保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactiveoxygen6species，ROS）水平，在氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用，IQM1缺失抑制了光誘導(dǎo)的氣孔張開(kāi)，iqm1突變體表現(xiàn)氣孔開(kāi)度小和根較短的表型[3]；IQM1過(guò)表達(dá)株系則表現(xiàn)為氣孔開(kāi)度大和根較長(zhǎng)[4]。IQM4（編號(hào)為At2g26190）是IQM家族中與IQM1高度同源的成員[5]，其功能未見(jiàn)報(bào)道。為了研究IQM4的基因功能，本文以IQM4基因?yàn)樗阉鲗?duì)象，檢索了兩個(gè)生物資源信息數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索到IQ

4、M4基因?qū)追N非生物脅迫均能產(chǎn)生應(yīng)答；為了驗(yàn)證生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中IQM4基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，本文開(kāi)展了鹽、甘露醇、脫水、低溫以及損傷處理對(duì)IQM4基因表達(dá)影響的分析，該研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展IQM4基因的功能研究提供重要理論依據(jù)?！　?實(shí)驗(yàn)材料　　實(shí)驗(yàn)所用的擬南芥（Arabidopsisthaliana）為Columbia（Col）生態(tài)型。MS鹽購(gòu)自Sigma公司，PrimeScriptOneStepRT-PCRKit，RNAisoPlus購(gòu)自TaKaRa公司，NaCl和Manntiol試劑購(gòu)于上海生工?！　?實(shí)驗(yàn)方法　　2.1擬南芥培養(yǎng)　　土壤培養(yǎng)：將經(jīng)過(guò)

5、4℃浸泡3d的吸漲種子直接點(diǎn)種于營(yíng)養(yǎng)土表面，置于長(zhǎng)日照培養(yǎng)室中培養(yǎng)（溫度為22±2℃，光周期為16h光照/8h黑暗，光照強(qiáng)度為100μmol?m-2?s-1，相對(duì)濕度為85%，下同）。　　1/2MS培養(yǎng)基培養(yǎng)：取經(jīng)過(guò)4℃浸泡3d的吸漲種子，用75%乙醇浸泡5～10s后棄乙醇，再加入0.1%HgCl2浸泡5min后棄HgCl2，用無(wú)菌水漂洗3～4次。最后加入適量的0.3%Agar溶液懸浮，接種到1/2MS培養(yǎng)基上，置于長(zhǎng)日照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。6　　2.2生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索　　以IQM4基因?yàn)樗阉鲗?duì)象，檢索AtGenExpressVisualizatio

6、nTool（http：//jsp.weigelworld.or）和GenevestigatorExpressionData（https：//www.genevestigator.com），以基因表達(dá)改變量為1.5倍為閾值，篩選對(duì)IQM4基因表達(dá)影響較大的非生物因素作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的依據(jù)?！　?.3非生物脅迫的處理　　滲透脅迫處理：將1/2MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2周的幼苗小心拔出，需保持幼苗的根的完整性，稱取30～50mg幼苗為一個(gè)樣品，共稱取6個(gè)樣品；將樣品浸沒(méi)于300mmol/L甘露醇溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。　　鹽脅迫處理：稱

7、取6個(gè)2周幼苗樣品，將樣品浸沒(méi)于150mmol/L氯化鈉溶液中，分別在0.5、1、3、6、12和24h取樣。　　低溫處理：稱取3個(gè)2周幼苗樣品；將樣品置于4℃處理，分別在0.5、1和3h取樣?！　∶撍幚恚悍Q取3個(gè)2周幼苗樣品；將樣品放在濾紙上，并置于長(zhǎng)日照培養(yǎng)室中，分別在0.5、1和3h取樣。　　損傷處理：先用帶有鋸齒的鑷子夾傷生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的2周幼苗，然后置于長(zhǎng)日照培養(yǎng)室中，分別在0.25和0.3h取樣?！　?.4IQM4基因的RT-PCR分析　　參照RNAisoPlus說(shuō)明書(shū)提取非生物脅迫處理的樣品總RNA?！　∫訧QM4編碼序列的特異引物F1

8、：5’-AGTTAGCTCTTCAGCATTGGC-3′和R1：5’-TCTTCTTGTTCCTCTGTAA