重組子的篩選與鑒定

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1、第六節(jié)重組體的篩選與鑒定轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞DNA的體外重組植物轉(zhuǎn)化體報道基因篩選法（1）大腸桿菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（β-D-glucuronidase，GUS）；（2）細(xì)菌和螢火蟲的熒光素酶（luciferase）；（3）水母綠色熒光蛋白（GFP）基因（GreenFluorescentProtein）。1.報告基因（reportergene)（4）其它幾種報道基因的作用原理4-甲-β-D

2、-葡糖醛酸熒光產(chǎn)物GUSGFP紫外光照發(fā)綠色熒光5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸藍(lán)色水解產(chǎn)物GUSFirefliesemitlightcatalyzedbyluciferasewithATP轉(zhuǎn)入螢火蟲的luciferase的煙草一、遺傳檢測法報告基因篩選、抗性標(biāo)志插入失活篩選、半乳糖苷酶藍(lán)白斑篩選、插入基因遺傳性狀篩選、二、分子檢測法PCR擴增檢測分子雜交檢測三、物理檢測法DNA電泳檢測限制酶酶切分析法四、免疫化學(xué)檢測法五、核酸序列分析平板篩選重組子的篩選與鑒定一、遺傳學(xué)檢測法重組體的篩選與鑒定---篩Ampr插入失活篩選:例1在Tet

3、r中插入目的基因在質(zhì)粒固有的功能基因內(nèi)插入目的基因，則該基因不能表達(dá)有功能的蛋白質(zhì)。原理：AmpTet1234563和5是陽性克隆123456兩種抗生素直接篩選（影印法）無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基環(huán)絲氨酸輔助篩選（1）四環(huán)素：抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。（2）氨芐青霉素抗性基因：產(chǎn)生?-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇醦BR322抗菌素標(biāo)記選擇原理（3）環(huán)絲氨酸：殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停止生長的細(xì)菌。如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，

4、保留下來；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。pUC18/19插入失活篩選:例2在LacZ中插入目的基因載體上帶有一個來自大腸桿菌的lac操縱子的DNA區(qū)段，可編碼β-半乳糖苷酶氨基端即α—肽鏈，IPTG可以誘導(dǎo)該片段的合成，而該片段能與宿主細(xì)胞所編碼的β-半乳糖苷酶羧基端互補(α-互補)。故暴露于誘導(dǎo)物IPTG的細(xì)菌含有編碼lacZ的質(zhì)?？赏瑫r合成該酶的兩種片段，該菌在其生色底物X-gal的培養(yǎng)基上生長形成藍(lán)色茵落。將一連串克隆位點克隆入質(zhì)粒的lacZ基因中，外源DNA插入質(zhì)粒的多克隆位點后可使β-半乳糖苷酶的氨基端片段

5、滅活，從而破壞了α-互補作用。因此，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落。利用這種篩選方法可方便地將含目的基因的重組子從空載體中篩選出來。這種現(xiàn)象被稱為是?-互補X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷IPTG:(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)?-互補(alpha-complementation)lacZ與藍(lán)白斑篩選?-互補(alpha-complementation)通過看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無插入時，互補，藍(lán)菌斑。MCS有插入時，不互補，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：無質(zhì)粒的受體菌?-半乳糖苷酶部分

6、缺失，不能分解Xgal；無抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌斑生長質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌?-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物?互補，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑生長帶外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌載體產(chǎn)物失活，不能互補?-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色菌斑生長利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進行直接選擇。（只在特定條件下）。轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。一、原理：2、根據(jù)插入基因的遺傳表型篩選彌補缺陷his-his+

7、受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。DNA電泳檢測法分子量Marker載體重組克隆三、物理檢測法根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子原理：有外源DNA片段插入載體后的重組DNA與載體DNA之間的大小差異?；痉椒ǎ禾崛∞D(zhuǎn)化子的DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳遷移慢的帶是重組DNA的帶。此法是對重組子進行分析鑒定的最基本、最簡單的方法，只適用于重組子的初步鑒定。二、酶切電泳篩選法1.原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶

8、切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較