實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)探究進(jìn)展及應(yīng)用

《實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)探究進(jìn)展及應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)探究進(jìn)展及應(yīng)用作者單位：473058河南省南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科1研究進(jìn)展?二十多年前，美國(guó)Perkin-Elmer8Cetus公司人類遺傳研究室Mullis等發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，這成為20世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域革命性創(chuàng)舉與里程碑，使人們夢(mèng)寐以求的體外無限擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實(shí)。幾年后，世界生物實(shí)驗(yàn)室中，PCR技術(shù)占據(jù)了統(tǒng)治地位，并成為分子生物領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)。大量特異性PCR產(chǎn)物的生成使許多新的DNA分析方法的使用成為可能，這些分析方法包括下游修飾或互補(bǔ)性產(chǎn)物分析技術(shù)。但是，利用傳統(tǒng)的PCR技術(shù)進(jìn)行

2、檢測(cè)鑒定時(shí)，需要將擴(kuò)增反應(yīng)后的電泳進(jìn)行分離及染色處理，且不能準(zhǔn)確定量，使其應(yīng)用受到限制。1992年，Higuchi最早提出了實(shí)時(shí)PCR的設(shè)想，它的基本思想是利用熒光染料EB(溴化乙錠)可以插入到雙鏈核酸中受激發(fā)光的性質(zhì)，在PCR反應(yīng)的退火或延伸時(shí)檢測(cè)摻入到雙鏈核酸中EB的含量就能實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，根據(jù)PCR反應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，結(jié)合相應(yīng)的算法，通過加入標(biāo)準(zhǔn)品的方法，就可以對(duì)待測(cè)樣品中的目標(biāo)基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量。但Higuchi利用的是嵌入熒光染料檢測(cè)，它只能簡(jiǎn)單地反映PCR反應(yīng)體系中總的核酸量，是一種非特異性的檢測(cè)方法。直到1995年，美國(guó)PE公

3、司研制成功具有革命性意義的熒光定量PCR技術(shù)，融合了PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化，以獲得特定區(qū)段擴(kuò)增產(chǎn)物定量的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測(cè)，完全閉管操作，克服了常規(guī)PCR技術(shù)的諸多難題。1996年美國(guó)AppliedBiosystems公司推出了成熟的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction.FQ-PCR)技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，標(biāo)志著DNA分析領(lǐng)域的又一次革命性飛躍。這種

4、先進(jìn)技術(shù)，是在原PCR方法基礎(chǔ)上的又一次進(jìn)展，使高效的DNA定量、定性分析，以及高靈敏性DNA擴(kuò)增成為可能。這種創(chuàng)新性的PCR技術(shù)可以對(duì)DNA擴(kuò)增過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。?8在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念-Ct值。C代表Cycle(循環(huán))，t代表threshold(閾值)，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。FQ-PCR是通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光

5、信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測(cè)需要專有儀器，能夠通過聯(lián)機(jī)收集每個(gè)擴(kuò)增周期的數(shù)據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器通過DNA分子中的熒光染色情況進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)定。每個(gè)PCR擴(kuò)增周期的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光測(cè)定結(jié)果顯示為點(diǎn)狀曲線。一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可分為三個(gè)典型時(shí)期：早期背景擴(kuò)增期、中期指數(shù)擴(kuò)增期以及晚期的平臺(tái)期。PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)模板的Ct

6、值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。?實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀可以使研究人員對(duì)DNA擴(kuò)增情況進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)，間接通過熒光信號(hào)測(cè)定，觀察PCR產(chǎn)物累計(jì)情況。?實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法有很多類型及亞型，每種方法均具有特有條件、復(fù)雜性及可靠性。所有這些實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法均可按照定量方法被分為兩種類型-絕對(duì)及相對(duì)定量。監(jiān)測(cè)方法選擇取決于分析復(fù)雜性以及最終結(jié)果。?8絕對(duì)定量可對(duì)單一靶序列進(jìn)行定量檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為絕對(duì)值(例如

7、：病毒載量copies/ml)。絕對(duì)定量FQ-PCR一般采用外標(biāo)準(zhǔn)品定量的制備來實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，可以通過化學(xué)合成目的基因；或是將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接梯度稀釋，或是將PCR產(chǎn)物克隆到載體上，然后抽提出質(zhì)粒，經(jīng)過測(cè)量濃度和拷貝數(shù)可準(zhǔn)確定量，它的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、準(zhǔn)確。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA常作為絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的樣品，并作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)未知樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)未知樣品的Ct值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中定出樣品的拷貝數(shù)。做好標(biāo)準(zhǔn)曲線至關(guān)重要，對(duì)于RNA樣品，標(biāo)準(zhǔn)品

8、最好是體外轉(zhuǎn)錄的RNA，如果用cDNA、PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，雖然制備簡(jiǎn)單易于保存，但是將會(huì)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品無法準(zhǔn)確指示樣品反轉(zhuǎn)