elisa試劑影響因素和常見問題分析

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1、ELISA試劑影響因素和常見問題分析1.標(biāo)本及采集、運(yùn)輸因素12.試劑的影響23.操作技術(shù)的影響34.顯色和比色55.HOOK效應(yīng)影響56.干擾物質(zhì)的影響57.藥物的影響68.抗原自身因素69.異常結(jié)果分析79.1白板79.2顯色弱、靈敏度低79.3靈敏度過高、板底高、背景高89.4假陽性89.5重復(fù)性差9由于ELISA（酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)）具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各種傳染性疾病的篩查如肝炎、艾滋病、優(yōu)生優(yōu)育等。雖然洗板只是ELISA實(shí)驗(yàn)重要環(huán)節(jié)中的一個(gè)，但作為專業(yè)的洗板機(jī)生產(chǎn)廠家，我們必須對(duì)影響ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果各因素有一定的認(rèn)識(shí)。優(yōu)質(zhì)的試劑、良好的儀器和正確的操作

2、是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。如不注意，就容易出現(xiàn)白板、花板、色弱和假陽性等現(xiàn)象。尤其是花板現(xiàn)象（就是空白、陰性、陽性對(duì)照以及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻明顯偏高）是各個(gè)廠家洗板機(jī)調(diào)試中經(jīng)常遇到的問題?，F(xiàn)將ELISA實(shí)驗(yàn)操作中注意事項(xiàng)總結(jié)如下，以期給大家?guī)硪恍﹩l(fā)，以改善洗板機(jī)的安裝調(diào)試水平，提高臨床檢測(cè)質(zhì)量。1.標(biāo)本及采集、運(yùn)輸因素嚴(yán)重溶血，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶催化活性，催化底物顯色造成假陽性；混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯內(nèi)不易洗凈；如有細(xì)菌污染，軍體內(nèi)可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；標(biāo)

3、本凝固不全，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；采血試管洗滌不干凈、反復(fù)使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。一般來說，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置在4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測(cè)定的標(biāo)本需要在-20℃保存。凍結(jié)血清溶解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不勻，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍛?yīng)先離心或

4、過濾，澄清后在檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冷凍；最好使用一次性玻璃試管或真空管采血；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶的活性；血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?.試劑的影響ELISA診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過度。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量ELISA反應(yīng)試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底

5、采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。也有廠家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)地對(duì)待反應(yīng)結(jié)果。基因工程抗原較合成肽抗原有無可比擬的優(yōu)越性，就HCV-ELISA試劑盒來說，第一代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，僅僅包括了HCV的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了?；蚬こ炭乖c合成肽抗原的區(qū)別如下：基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核

6、或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。穩(wěn)定性好。包被的抗原穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被原料的試劑盒效期只有3-4個(gè)月，采用基因工程抗原后，效期大大延長(zhǎng)了?；蚬こ炭乖瓕⑻禺愋钥乖瓫Q定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的敏感度，提高檢出率。純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g(shù)難度較大。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合

7、成肽抗原有一下特點(diǎn)：?分子量小；?一般只含有一個(gè)抗原決定簇；?純度高；?穩(wěn)定性差；國(guó)內(nèi)乙肝兩對(duì)半試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度和差異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%—99.3%,78%—89%存在較大差異。有的廠家酶標(biāo)板空間A值差大于15%；標(biāo)記酶的活性及顯色的穩(wěn)定性比較差。使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。選擇試劑時(shí)應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差小、操作方便省時(shí)