pcr常見問題的常見原因

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1、1.cDNA產(chǎn)量的很低?可能的原因：*RNA模板質量低*對mRNA濃度估計過高*反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足*同位素磷32過期*反應體積過大，不應超過50μl?2.擴增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺?*最常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系*與反應起始時RNA的總量及純度有關*建議在試驗中加入對照RNA*第一鏈的反應產(chǎn)物在進行PCR擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈

2、合成。由于RNA模板存在二級結構，如環(huán)狀結果，有可能導致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉錄酶無法從此引物進行有效延伸。*目的mRNA中含有強的轉錄中止位點，可以試用以下方法解決：a.將第一鏈的反應溫度提高至50℃。b.使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行第一鏈反應。?3.產(chǎn)生非特異性條帶?*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNaseI重新處理樣品。*在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產(chǎn)生非特異性結果。在低于引物Tm2至5℃的溫度下進行

3、退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產(chǎn)生。*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導致產(chǎn)生不同的RT-PCR結果。?4.產(chǎn)生彌散（smear）條帶?*在PCR反應體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高*減少引物的用量*優(yōu)化PCR反應條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。?5.產(chǎn)生大分子量的彌散條帶?*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的*對于長片段的PCR，建議將反

4、應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）?6.在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果?*通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進行體外轉錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。*有可能是引物二聚體的條帶?7.擴增產(chǎn)物滯留在加樣孔中?*有可能是由于模板量過高而導致PCR結果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增。*另外，在二次PCR時使用的退火

5、溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。?8.SSⅢ與SSⅡ有何不同？?*具有更高的熱穩(wěn)定性（達50℃）*具有更長的半衰期（達220分鐘）*對PCR無抑制*干冰運輸*Tdt活性更低?9.為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？?ThermoScript如果保存不當會引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。?10.為什么使用基因特異性引物（GSP）？?GSP在擴增低豐度的轉錄本時是最好的。OligodT引物建議用于高質量RNA及全長轉錄本的逆轉錄；隨機引物用于

6、mRNA片段的逆轉錄。?11.什么情況下需要使用RNaseH？?在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時?12.根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：目的?建議?RT與PCR使用不同的引物或需要靈活選擇PCRDNA聚合酶?兩步法RT-PCR系統(tǒng)?高靈敏度?一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)?高特異性?含有適當?shù)腄NA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)或具有高保真PlatinumTaq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)?高保真度?含有PfxTaq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)?長的反轉錄結果?通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可

7、達到最佳結果含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)???二、Generacer?1.如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物（GSP）？?使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時需要注意以下幾點要求：*50-70％的GC含量，以提高引物熔點（Tm）*23-28個堿基長度，以提高引物特異性*降低3’端GC含量，將引物非特異性結合的可能性降至最低?2.為什么得不到RACE產(chǎn)物？?*加入Hela對照*低質量的RNA模板*逆轉錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模

8、板cDNA的合成*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式PCR*目的基因沒有表達，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因*目的基因太長而不適合進行反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的OligodT來得到全長cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進行PCR。*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應參數(shù)及反應體系；降低退火溫度；使用5-1