pcr常見問題的常見原因

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1、PCR常見問題的常見原因1.cDNA產(chǎn)量的很低可能的原因：*RNA模板質(zhì)量低*對(duì)mRNA濃度估計(jì)過高*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足*同位素磷32過期*反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50μl2.12擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺*最常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系*與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)*建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA*第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RN

2、A模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。*目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：a.將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。b.使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。3.產(chǎn)生非特異性條帶*用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNaseI重新處理樣品。*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的

3、產(chǎn)生。*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。4.12產(chǎn)生彌散（smear）條帶*在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高*減少引物的用量*優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。5.產(chǎn)生大分子量的彌散條帶*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的*對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）6.在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照

4、RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果*通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。*有可能是引物二聚體的條帶7.12擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中*有可能是由于模板量過高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。*另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。8.SSⅢ與SSⅡ有何不同？*具有更高的熱穩(wěn)定性（達(dá)50

5、℃）*具有更長(zhǎng)的半衰期（達(dá)220分鐘）*對(duì)PCR無抑制*干冰運(yùn)輸*Tdt活性更低9.為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？ThermoScript如果保存不當(dāng)會(huì)引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。10.12為什么使用基因特異性引物（GSP）？GSP在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；隨機(jī)引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。11.什么情況下需要使用RNaseH？在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)12.根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：目的建議RT與PCR使用不同的引

6、物或需要靈活選擇PCRDNA聚合酶兩步法RT-PCR系統(tǒng)高靈敏度一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)高特異性含有適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)或具有高保真PlatinumTaq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)高保真度含有Pfx12Taq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可達(dá)到最佳結(jié)果含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)二、Generacer1.如何針對(duì)Generacer試劑盒設(shè)計(jì)基因特異性引物（GSP）？使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：*

7、50-70％的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)（Tm）*23-28個(gè)堿基長(zhǎng)度，以提高引物特異性*降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低2.12為什么得不到RACE產(chǎn)物？*加入Hela對(duì)照*低質(zhì)量的RNA模板*逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(zhǎng)模板cDNA的合成*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來解決，建議使用巢式PCR*目的基因沒有表達(dá)，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因*目的基因太長(zhǎng)而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的OligodT來得到全長(zhǎng)cDNA，使用隨機(jī)引物或

8、與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過高GC含量