發(fā)酵染菌原因分析

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1、發(fā)酵染菌原因分析第一部分：基礎知識1）雜菌的類型空氣中的微生物大多數(shù)是細菌和芽孢,還有一定數(shù)量的霉菌、酵母和病毒。細菌的大小有零點幾微米至幾個微米.根據(jù)以上特點我們應得出如下結論：A：這些微生物在空氣中極少單獨游離存在,基本上是附著于灰塵、液滴等微粒的表面上。B：介質(zhì)過濾除菌就是把空氣中的各種微粒和極少量的游離微生物捕集起來予以除掉。因此我們通常所用的空氣過濾器為什么0.3u可以保證無菌發(fā)酵生產(chǎn)的原因。2）無菌檢查與染菌的處理在抗生素生產(chǎn)過程中,為了及早發(fā)現(xiàn)染菌并進行恰當處理,保證生產(chǎn)正常進行,對菌種制備、種子罐、發(fā)酵罐的接種前

2、后和培養(yǎng)過程中,須要按工藝規(guī)程要求按時取樣，進行無菌檢驗。A：無菌檢查培養(yǎng)液是否污染雜菌可從三個方面進行分析：a:無菌試驗b:培養(yǎng)液的顯微鏡拉查c:培養(yǎng)液的生化指標變化情況。其中無菌試驗是判斷染菌的主要依據(jù)。無菌試驗現(xiàn)在采用的無菌試驗方法有肉湯培養(yǎng)法、雙碟培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法。其中以酚紅肉湯培養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法結合起來進行無菌檢查用的較多。(1)肉湯培養(yǎng)法直接用裝有酚紅肉湯的無菌試管取樣,然后放入37℃恒溫室(箱)內(nèi)培養(yǎng)。定時觀察試管內(nèi)肉湯培養(yǎng)基的顏色變化,同時進行顯微鏡觀察。（2）斜面培養(yǎng)法先用空白無菌試管取樣,然后在無菌條件下接

3、種于斜面培養(yǎng)基上,置于37℃恒溫室(箱)內(nèi)培養(yǎng)。定時觀察有無雜菌菌落生長。。（3）雙碟培養(yǎng)法種子罐樣品先取入肉湯培養(yǎng)基中,然后在無茵條件下在雙碟培養(yǎng)基上面劃線,剩下的肉湯培養(yǎng)物在恒溫室(箱)內(nèi)培養(yǎng)6小時后復劃線一次,發(fā)酵罐培養(yǎng)液直接取入空白無菌試管中,于37℃下培養(yǎng)6小時后在雙碟培養(yǎng)基上劃線。24小時內(nèi)的雙碟定時在燈光下檢查有無雜菌生長。24小時~48小時的雙碟1天檢查一次,以防生長緩慢的雜菌漏檢。正常生產(chǎn)過程中,種子罐和發(fā)酵罐每隔8小時取樣一次,進行無菌檢查。該方法經(jīng)常用于單菌落挑選，可以從染有雜菌的培養(yǎng)液中經(jīng)多次劃線挑取單菌

4、落進行分離培養(yǎng)，得到純種的種子。無菌試驗的結果一般需要8~12小時才能作出判斷。為了縮短判斷時間,有時向培養(yǎng)基中加入赤霉素、對氨基苯甲酸等生長激素以促進雜菌的生長。B:染菌的判斷培養(yǎng)基的染菌判斷是錯綜復雜的工作,又是一種細微觀察、認真分析的王作。染菌罐的判斷方法：以無菌試驗中的酚紅肉湯培養(yǎng)和雙碟培養(yǎng)的反應為主,以鏡檢為輔。每個無菌樣品的無菌試驗，至少用2只酚紅肉湯或斜面同時取樣培養(yǎng)。要定量或用接種環(huán)蘸取法取樣，公司現(xiàn)階段基本都直接從發(fā)酵罐直接取樣。因取樣量不同,影響顏色反應和渾濁程度的觀察。如果連續(xù)3個時間的酚紅肉湯無菌樣發(fā)生顏

5、色變化或產(chǎn)生渾濁,或斜面連續(xù)3個時間樣品長出雜菌即判斷為染菌。有時酚紅肉湯反應不明顯,要結合鏡檢確認連續(xù)3個時間樣品染菌，即判為染菌。各級種子罐的染菌判斷亦參照上述規(guī)定。對肉湯和無菌斜面的觀察及保存期的規(guī)定,發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后應取無菌樣，以后每隔8小時取無菌樣一次，直至放罐。無菌試驗的肉湯和雙碟應保存并觀察至本罐批放罐后12小時，確認無雜菌污染后方可棄去。無菌檢查時間應每6小時觀察一次無菌試驗樣品，以便能及早發(fā)現(xiàn)染菌。2、染茵率的統(tǒng)計以發(fā)酵罐染菌罐批(次)為基準,染菌罐批(次)應包括染菌重消后的重復染菌的灌（批）次在內(nèi)。發(fā)酵總過程

6、(全周期)無論前期或后期染菌,均作“染菌”論處。發(fā)酵罐染菌罐批(次)染菌率(％)＝一一一一一一一一－－－X100%總投罐批(次)3）染菌(包括染噬菌體)的處理(一)污染雜菌的處理發(fā)酵罐污染雜菌后,依據(jù)染菌時間、所染雜菌的危害性及時進行處理,同時對所涉及的設備也要及時處理。a.種子罐染菌的處理種子罐染菌后都不能往下道工序移種,要及時用高壓蒸汽直接滅菌后經(jīng)過濾處理放下水。b.發(fā)酵罐染菌的處理發(fā)酵罐前期染菌,污染的雜菌對產(chǎn)生菌的危害性大,采用蒸汽滅菌經(jīng)過濾處理后放掉;如果危害性不大,可用重新滅菌、重新接種的方式處理,如營養(yǎng)成分消耗較多

7、,可放掉部分培養(yǎng)液補入部分新培養(yǎng)基后進行滅菌,重新接種；如污染的雜菌量少且生長緩慢,可以繼續(xù)運轉下去,但要時刻注意雜菌數(shù)量和代謝的變化。在發(fā)酵的中后期染菌,一是加入適量的殺菌劑,如呋喃西林或某些抗生素,抑制雜菌的生長。二是降低培養(yǎng)溫度或控制補料量來控制雜菌的生長速度。如果采用上述兩種措施仍不見效,就要考慮提前放罐。c、染菌后的設備處理..染菌后的罐體用甲醛等化學物質(zhì)處理,再用蒸汽滅菌〈包括各種附屬設備〉。在再次投料之前,要徹底清洗罐體、附件,同時進行嚴密程度檢查,以防滲漏。染菌后的處理尤為重要，很多大面積染菌都是由于處理不徹底而

8、造成的系統(tǒng)污染，造成無法及時處理好各個環(huán)節(jié)出現(xiàn)連續(xù)污染。(二)污染噬菌體的處理抗生素等產(chǎn)品發(fā)酵過程中有時出現(xiàn)噬菌體污染,輕者造成生產(chǎn)能力大幅度下降,重者造成停產(chǎn)。一般噬菌體污染后往往出現(xiàn)發(fā)酵液突然轉稀,泡沫增多,早期鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體染色不均勻，在較短時間內(nèi)菌體大量自