western blotting 綜述

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1、WesternBlotting定義:免疫印跡是一個用于蛋白質分析的常規(guī)技術，在電場的作用下將電泳分離的蛋白從凝膠轉移至一種固相支持物，然后利用抗原-抗體的特異性反應，從蛋白混合物中檢測出目標蛋白，從而定量或定性的確定正?；驅嶒灄l件下細胞或組織中目標蛋白的表達情況。它是根據(jù)抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。westernblot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術。特點:WesternBlot結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種優(yōu)點，可檢測到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

2、組成:典型的印跡實驗包括三個步驟①蛋白質的電泳分離；②將電泳后凝膠上的蛋白質轉移至固體膜上，用非特異性，非反應活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質區(qū)域；③免疫學檢測。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進行免疫學分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度，使其成為使用最廣泛的免疫化學方法之一。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質轉移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉移的方法多用電泳轉移，它又有半干法和濕法之分，現(xiàn)在大多用濕法。第三步

3、是用特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的?，F(xiàn)在多用間接免疫酶標的方法，在用特異性的第一抗體雜交結合后，再用酶標的第二抗體（堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗第一抗體的抗體）雜交結合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來顯示抗原的存在。該技術被廣泛應用于蛋白表達水平的檢測中?；驹硪约安僮鞯谝徊糠郑篠DS-PAGE電泳1、電泳樣品的制備---蛋白質的變性.蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的PH值下表現(xiàn)出不同的電荷，為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有

4、關，我們在上樣前，通常會進行一些處理(上樣緩沖液)。即在樣品中加入含有SDS和β-巰基乙醇的上緩沖液。SDS即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+），是一種陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構；β-巰基乙醇是強還原劑，它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。電泳樣品加入樣品處理液后，經(jīng)過高溫處理，其目的是將SDS與蛋白質充分結合，以使蛋白質完全變性和解聚，并形成棒狀結構同時使整個蛋白帶上負電荷；另外樣品處理液中通常還加入溴酚藍染料，溴酚藍指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的

5、前沿位置，當指示劑到達凝膠底部時，即可停止電泳。用于監(jiān)控整個電泳過程；另外樣品處理液中還加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部。當樣品上樣并接通兩極間電流后(電泳槽的上方為負極，下方為正極)，在凝膠中形成移動界面并帶動凝膠中所含SDS負電荷的多肽復合物向正極推進。樣品首先通過高度多孔性的濃縮膠，使樣品中所含SDS多肽復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。2、凝膠制備以及電泳2.1SDS-PAGE凝膠配制配制相應濃度的SDS-PAGE分離膠，TEMED加入后迅速混勻制膠，沿壁迅速灌注分離膠溶液，留出積層膠所需空間（梳

6、齒長再加1cm）。覆蓋5mm水(或異丙醇）層于分離膠溶液上，約30-60min后分離膠和水層之間會出現(xiàn)清晰界面，表明分離膠充分聚合（可微微傾斜模具，檢測凝膠是否聚合）。ddH2O輕輕洗滌凝膠頂部數(shù)次，以除去未聚合的凝膠，再用濾紙吸凈殘留液體，注意不要接觸膠面。覆蓋層可保持膠面平整和防止空氣進入，因為氧氣擴散進入凝膠會抑制聚合反應。灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。膠濃度＜10%時可用0.1%的SDS封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS

7、。封膠后切記，勿動。配制相應體積的積層膠液體，在已聚合分離膠上直接灌注積層膠液體，立即插入加樣梳，并在空隙處補足積層液液體（小心避免混入氣泡），室溫靜置30～60min至完全聚合，將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽加入Tris甘氨酸電泳緩沖液，至少要淹沒加樣孔。小心拔出加樣梳，避免損壞加樣孔，如加樣孔有氣泡，可向其中加入適量電泳緩沖液將氣泡驅除；若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正。凝膠的質量直接影響以后的實驗結果，要特別注意幾點：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點樣孔平整。2