western blotting操作指南

《western blotting操作指南》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。

1、WesternBlot操作指導(dǎo)一：蛋白提取1、組織蛋白提取1）所需器材：制冰機(jī)、標(biāo)記筆、兩套1.5mlEP管（最好高溫高壓處理）、一個(gè)大冰盒、一個(gè)1.5mlEP管盒、手套、眼科剪（最好高溫高壓處理）、新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織、保存于4℃冰箱的PBS（最好高溫高壓處理）、移液槍、吸頭（最好高溫高壓處理）、兩套研磨棒（最好高溫高壓處理）、掌上離心機(jī)、濾紙、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、離心機(jī)、燒杯、2×SDS凝膠上樣緩沖液、二硫蘇糖醇（DTT）、震蕩器、泡沫板。2）操作步驟：a.制冰機(jī)制冰；b.標(biāo)記筆將兩套EP管做好標(biāo)記；c.

2、將大冰盒、EP管盒裝上冰，一套標(biāo)記筆做好標(biāo)記的EP管放置于大冰盒中，另一套標(biāo)記筆做好標(biāo)記的EP管放置于EP管盒中，戴好手套，帶上EP管盒、眼科剪剪取黃豆大小（約100mg）新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織；d.取出保存于4℃冰箱的PBS，往EP管中滴加1mlPBS，眼科剪剪碎組織（動(dòng)作快），掌上離心，棄上清，再往EP管中滴加1mlPBS，研磨棒研磨，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清，濾紙盡可能吸干管口殘留液體，估算EP管中沉淀物體積，以上步驟盡可能在冰上操作；e.從4℃冰箱取出三去污裂解液，-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中，往EP管中滴加沉淀物3-5倍體積的三

3、去污裂解液（一般為5倍）,再加入PMSF（二者比例為94：6）,研磨棒研磨（冰上充分裂解20-30分鐘），以上步驟均需在進(jìn)行；f.離心機(jī)預(yù)冷，將充分裂解后的組織液4℃、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘；g.將燒杯用自來(lái)水洗凈，倒入單蒸水，電爐上煮沸；h.備好2×SDS凝膠加樣緩沖液（存放于常溫），取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中，將離心后的上清液用移液槍定量吸至另一套EP管中（勿吸取下層沉淀物），按上清液：2×SDS：DTT=1:0.8:0.2加入2×SDS及DTT，掌上離心，然后小心將EP管插入泡沫板，投入已煮沸的燒杯中煮6-8分鐘（電爐功率不要調(diào)太大，以免

4、管蓋爆開(kāi)）；i.將泡沫板用鑷子取出，置大冰盒中冷卻10分鐘，掌上離心，再放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。注意：裂解液也可酌情選用單去污裂解液或細(xì)胞裂解液等。2、貼壁細(xì)胞蛋白提?。?xì)胞蛋白含量一般約為1x10-9mg/細(xì)胞）1）所需器材：制冰機(jī)、細(xì)胞刮刀、標(biāo)記筆、兩套1.5mlEP管（最好高溫高壓處理）、兩個(gè)大冰盒、手套、長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶、保存于4℃冰箱的PBS、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、移液槍、吸頭（最好高溫高壓處理）、濾紙、離心機(jī)、燒杯、4×SDS凝膠上樣緩沖液、二硫蘇糖醇（DTT）、泡沫板。2）操作步驟a.制冰機(jī)制冰；b.細(xì)胞刮

5、刀用去離子水洗凈、甩干，標(biāo)記筆將2套EP管做好標(biāo)記；c.將兩個(gè)大冰盒裝上冰，標(biāo)記筆做好標(biāo)記的兩套EP管置于一個(gè)大冰盒上,帶上另一個(gè)大冰盒，取出長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶平放在大冰盒上；d.戴好手套，取出保存于4℃冰箱的PBS、三去污裂解液、保存于-20℃冰箱的PMSF置于放有EP管的大冰盒上，往培養(yǎng)瓶中滴加2mlPBS漂洗一次，濾紙盡可能吸干瓶口殘留液體；e.往培養(yǎng)瓶中滴加三去污裂解液（一般為47－141ul/50ml培養(yǎng)瓶）、再加入PMSF（二者比例為94：6），然后用細(xì)胞刮棒刮（不要漏刮四周瓶壁，刮不同處理組要更換刮子或重新洗凈，濾紙擦干），傾角靜置（使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞裂解

6、液集于一角），移液槍將培養(yǎng)瓶的裂解液吸至1.5mlEP管，冰上靜置15-25分鐘，以上步驟均需在冰上操作；f.離心機(jī)預(yù)冷，將靜置15-25分鐘后的EP管4℃、10000轉(zhuǎn)離心10分鐘；g.將燒杯用自來(lái)水洗凈，倒入單蒸水，電爐上煮沸；h.備好4×SDS凝膠上樣緩沖液（存放在常溫），取出保存于-20℃冰箱的DTT置于冰上，用移液槍將離心后的上清液定量吸至另一套EP管中（勿吸取下層沉淀物），按上清液：4×SDS：DTT=3：0.8:0.2滴加4×SDS及DTT，掌上離心，然后小心將EP管插入泡沫板，投入已煮沸的燒杯中煮6-8分鐘（電爐功率不要調(diào)太大，以免管蓋爆開(kāi)）；i.

7、將泡沫板用鑷子夾出，置大冰盒中冷卻10分鐘，掌上離心，再放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。注意：裂解液也可酌情選用單去污裂解液或細(xì)胞裂解液等。3、懸浮細(xì)胞蛋白提取1）所需器材：制冰機(jī)、標(biāo)記筆、兩套1.5mlEP管（最好高溫高壓處理）、兩個(gè)大冰盒、長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶、10ml離心管、手套、移液槍、吸頭（最好高溫高壓處理）、濾紙、保存于4℃冰箱的PBS（最好高溫高壓處理）、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、離心機(jī)、燒杯、4×SDS凝膠上樣緩沖液、二硫蘇糖醇（DTT）、泡沫板。2）操作步驟a.制冰機(jī)制冰；b.標(biāo)記筆將2套EP管做好標(biāo)記；c.將兩個(gè)大冰

8、盒裝上冰，