紙片法抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)

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1、紙片法抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)4.3標(biāo)準(zhǔn)比濁管用硫酸鋇比濁管（0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)），標(biāo)定接種菌液濃度。比濁管制備方法如下：（1）0.048mol/LBaCl2，（1.175%w/vBaCl2·2H2O）0.5ml，加到99.5ml的0.18mol/L（0.36N）H2SO4（1％v/v）溶液中，制成比濁管；（2）用光徑為1cm的分光光度計(jì)測(cè)定光吸收來(lái)標(biāo)定比濁管。0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管在625nm波長(zhǎng)的吸收光度應(yīng)為0.08-0.1；（3）選管徑與制備菌液試管相同的螺口試管，每管分裝4－6ml；（4）將試管帽擰緊，放室溫暗處保存；（5）用前，將比濁管在旋轉(zhuǎn)振蕩器

2、上混勻。如出現(xiàn)大顆粒，應(yīng)更換；（6）每個(gè)月更換比濁管或復(fù)檢比濁管的濁度。5操作步驟5.1制備接種菌液5.1.1增菌法步驟如下：（1）選瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落至少4－5個(gè)，用接種環(huán)挑其頂部，移至4－5ml肉湯或大豆酪蛋白消化液中；（2）置35℃培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到或超過(guò)比濁管濃度（一般需2－6小時(shí)），濃度約1－2×108CFU/ml；（3）用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度，與比濁管相同?？捎霉怆姳葷?。目測(cè)比濁須在適當(dāng)光照下以黑色線條為反襯。5.1.2直接菌懸液法步驟如下：（1）做常規(guī)藥敏試驗(yàn)，可直接用過(guò)夜培養(yǎng)的菌落（必須用無(wú)選擇性培養(yǎng)基平板，如普通瓊脂培養(yǎng)基）在

3、鹽水或肉湯中制備接種菌液。菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)瞎埽?2)此法適用于在肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不好的細(xì)菌如嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌和鏈球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐藥試驗(yàn)；（3）當(dāng)用此法做復(fù)方磺胺藥的試驗(yàn)時(shí)，從平板上直接挑菌落時(shí)會(huì)攜帶相當(dāng)量的拮抗劑，造成敏感菌株的抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微的生長(zhǎng)菌膜。5.2接種平板步驟如下：（1）校正的菌液須在15分鐘內(nèi)使用。用一無(wú)菌棉試子蘸取菌液并在上端管壁旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過(guò)多的菌液；（2）用試子涂布整個(gè)瓊脂平板表面，反復(fù)涂布幾次，每次將平皿旋轉(zhuǎn)60度，保證涂布均勻。（3）將平皿蓋打開(kāi)3－5分鐘，使培養(yǎng)基表面的水份吸收掉。然

4、后貼藥敏紙片；（4）注意：避免用過(guò)濃的菌液，禁用未經(jīng)稀釋菌或其他不標(biāo)準(zhǔn)菌液接種平板。5.3貼紙片（1）接種平板后，貼上藥敏紙片。用鑷子或針尖壓一下紙片使其與培養(yǎng)基表面貼牢。紙片要貼得均勻，紙片與紙片中心距離不得小于24mm。原則上，直徑150mm得平板貼12張紙片，直徑100mm平板貼5張紙片。紙片貼后不應(yīng)再移動(dòng)，因?yàn)橛行┧幬飼?huì)立即擴(kuò)散；（2）貼上紙片15分鐘內(nèi)，須把平板倒放在35℃恒溫箱中。因?yàn)橐志h(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)是在普通環(huán)境中標(biāo)定的，所以除嗜血桿菌和淋病奈瑟氏菌外，平板不可放在高CO2的環(huán)境中。CO2與某些因素作用可使抑菌環(huán)增大。5.4讀取結(jié)果（1）經(jīng)16－

5、18小時(shí)培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。菌液濃度適合且涂得好，抑菌環(huán)規(guī)則，細(xì)菌呈融合生長(zhǎng)。如果出現(xiàn)單個(gè)菌落，說(shuō)明接種量小，需重做試驗(yàn)，測(cè)量抑菌環(huán)直徑須包含紙片直徑：手持平皿從背面目測(cè)檢查每塊平板，借反射光（黑色無(wú)放光背景），用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌環(huán)直徑，單位為毫米。培養(yǎng)基中如果加了血液，須打開(kāi)平皿蓋，借反射光，從正面量抑菌環(huán)。如果是葡萄球菌或腸球菌，須培養(yǎng)24小時(shí)后，經(jīng)投射光檢查苯唑青霉素和萬(wàn)古霉素的抑菌環(huán)內(nèi)有無(wú)耐藥菌株的生長(zhǎng)。抑菌環(huán)內(nèi)有任何生長(zhǎng)的表現(xiàn)都表明是耐藥菌株。（2）肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)的區(qū)域?yàn)橐志h(huán)邊緣，有很難辨認(rèn)的細(xì)小菌落不算。如抑菌環(huán)內(nèi)有大量

6、細(xì)菌生長(zhǎng)，須再移植出來(lái)，重新鑒定，重新做藥敏試驗(yàn)。變形菌在某些抗菌藥物紙片周?chē)蓮浡L(zhǎng)到抑菌的區(qū)域內(nèi)，當(dāng)抑菌環(huán)邊緣清楚，彌漫生長(zhǎng)不算。甲氧芐氨嘧啶和磺胺藥的拮抗劑會(huì)支持細(xì)菌生長(zhǎng)，因而測(cè)這類藥時(shí)可忽略輕微生長(zhǎng)（80％以上受抑制），以濃密生長(zhǎng)的區(qū)域作為抑菌環(huán)的界限。用加血的培養(yǎng)基測(cè)鏈球菌，測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)不包括溶血環(huán)。（3）參照表2的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)抑菌環(huán)的大小作出解釋，以敏感、中介或耐藥的形式解釋結(jié)果。6嬌嫩細(xì)菌Mueller-Hinton培養(yǎng)基只適用于快速生長(zhǎng)的細(xì)菌，一般不適于測(cè)定嬌嫩細(xì)菌。嬌嫩細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)如果要用紙片法做，培養(yǎng)基、質(zhì)量控制方法、解釋標(biāo)準(zhǔn)都須做修改以

7、適合每種細(xì)菌。以下介紹的紙片方法用于流感嗜血桿菌，淋病奈瑟氏菌和肺炎鏈球菌等嬌嫩細(xì)菌，結(jié)果是準(zhǔn)確的。其他細(xì)菌須用稀釋法測(cè)定。厭氧菌不能用紙片擴(kuò)散法測(cè)定抗菌藥物敏感性。結(jié)果解釋8.1抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2、2A、2B和2C。表中所列的敏感類別首先是經(jīng)過(guò)將抑菌環(huán)直徑與肉湯或平板稀釋法測(cè)定的最低抑菌濃度（MIC）進(jìn)行比較，并且根據(jù)已知敏感和抗菌株的抑菌環(huán)或MIC的群體分布得出的。然后再結(jié)合MIC與抑菌環(huán)直徑的相關(guān)分布，結(jié)合藥物常用劑量的臨床藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)系進(jìn)行分析。最終還要結(jié)合臨床的治療效果對(duì)體外試驗(yàn)和藥理的數(shù)據(jù)做綜合評(píng)價(jià)。8.2敏感度分級(jí)8.2.

8、1敏感表示被測(cè)菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效。