間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及其類髓核細(xì)胞分化導(dǎo)向

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1、精選公文范文管理資料間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及其類髓核細(xì)胞分化導(dǎo)向　　間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells,MSCs）是來源于中胚層的未分化的發(fā)育早期細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化能力。在特定的內(nèi)環(huán)境和一定的細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用下，其可定向分化為多種組織細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，正是由于其所具有的特性，使其成為了組織工程學(xué)中最常用的種子細(xì)胞?！　∮捎诠撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,[鍵入文字][

2、鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料BMSCs）具有取材方便、體外培養(yǎng)簡單、繁殖能力強(qiáng)、供體創(chuàng)傷小、不涉及倫理問題、良好的組織相容性、及其低抗原性所表現(xiàn)出的低免疫反應(yīng)性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為了組織工程中經(jīng)常使用的間充質(zhì)干細(xì)胞。國內(nèi)外均有使用一定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)BMSCs增殖和分化為類軟骨細(xì)胞及類髓核細(xì)胞的相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)抽取新西蘭兔的骨髓細(xì)胞，利用全骨髓貼壁法分離間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過傳代培養(yǎng)后再通過中胚層定向誘導(dǎo)分化的方法對所獲取的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，確定其定向分化能力，再以轉(zhuǎn)化生長因子3（TransformingGr

3、owthFactor-3,TGF-）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（BoneMorphogeneticProtein-7,BMP-7）生長因子誘導(dǎo)其向類髓核細(xì)胞分化，為組織工程髓核的構(gòu)建提供良好的種子細(xì)胞選擇?！　?材料和方法　　1.1材料與試劑　　DMEM-LG培養(yǎng)基（Gibcol）、胎牛血清（Gibcol）、DMEM-HG培養(yǎng)基（Gibcol）、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（地塞米松10-9M，抗壞血酸鈉0.2mM，-甘油磷酸鈉10mM，5%FBS，DMEM-LG培養(yǎng)基，1%雙抗溶液）、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（地塞米松[鍵入文字][鍵入

4、文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料10-7M，抗壞血酸鈉0.2mM，丙酮酸鈉1mM，轉(zhuǎn)化生長因子-110ng/ml，ITS+LA，DMEM-HG培養(yǎng)基，2%FBS，1%雙抗溶液）、成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基（地塞米松10-7M，吲哚美辛0.05mM，IBMX0.5mM，2%FBS，DMEM-HG培養(yǎng)基，1%雙抗溶液）、茜素紅S（Roche）、羊抗牛Ⅱ型膠原多克隆抗體（SouthernBiotechno-logy）、番紅O（Sigma）、油紅O（Sigma）、TGF-3（sigma）、BMP-7（sigma），CD2

5、9、CD105、CD166均購自eBioScience。新西蘭兔購自上海生旺實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限公司?！　?.2兔BMSCs的分離培養(yǎng)　　取2月齡的新西蘭大白兔，雌雄不限，戊巴比妥溶液腹腔麻醉后，常規(guī)備皮，消毒，嚴(yán)格無菌操作，以骨髓穿刺針接10ml注射器（注射器內(nèi)含稀釋的肝素鈉3000U/0.2ml）自脛骨近端內(nèi)側(cè)處行骨髓穿刺術(shù)，抽取骨髓液3ml，緩慢注入預(yù)置4ml淋巴細(xì)胞分層液的離心管內(nèi)，進(jìn)行密度梯度離心。2000rpm[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料離心20分鐘后，吸取中間的單個核細(xì)胞

6、層，棄去上清和脂肪，PBS（PhosphateBufferedSaline,磷酸鹽緩沖液）緩沖液沖洗2次，再以1.6×104/cm2的濃度接種于100mm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入15mlHam’sF12培養(yǎng)液（含青霉素鈉100U/ml，鏈霉素100g/ml，兩性霉素B0.25g/ml)，加入胎牛血清終濃度為10%，置37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)，于48小時后換液，以PBS沖洗3遍，去除全部非貼壁細(xì)胞，換上新鮮培養(yǎng)基，同樣環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3日換液一次，待原代培養(yǎng)細(xì)胞爬滿培養(yǎng)瓶底時，即可進(jìn)行傳代。用0.2

7、5%的胰蛋白酶消化5分鐘后，即可得兔原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液?！　?.3兔BMSCs表面抗原的鑒定　　取生長匯合約90%的第3代細(xì)胞，小心吸去培養(yǎng)液，加入3ml0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液，于37℃消化約3分鐘，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液1ml中止消化，PBS沖洗兩次，以1000rpm離心5[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料分鐘，棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，取100l細(xì)胞懸液置于流式管中，按照試劑說明加入抗體，充分混勻后室溫避光

8、放置30分鐘，加入流式細(xì)胞儀緩沖液1ml混勻后1000rpm離心5分鐘，棄去上清，再加入0.5ml流式細(xì)胞儀緩沖液重懸細(xì)胞后，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。　　1.4兔BMSCs的誘導(dǎo)分化　　1.4.1向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化　　取基本鋪滿瓶底的第3代細(xì)胞，胰蛋白酶消化后以2×104/cm2的密度接種于24孔板中，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每3天換液一次，培養(yǎng)14天后行茜素紅S染色?！　?.4.2向成軟骨細(xì)胞方向誘