髓核細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和永生化的研究

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1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文摘要第一部分：利用抽吸法誘導(dǎo)兔椎間盤椎退變模型目的:探討利用抽吸法構(gòu)建兔椎間盤退變模型，并觀察其病理及影像表現(xiàn)。方法:10月齡健康新西蘭大耳白兔28只，對照組7只，實驗造模組21只。利用21G皮膚穿刺針分別在造模組兔L4/5單節(jié)段刺入，抽吸髓核越0.008~0.012g。造模完畢，實驗兔繼續(xù)培養(yǎng)4-20周。造模前后利用，X-ray平片、MRI及Alcianblue組織染色觀察退變椎間盤的變化。結(jié)果:造模前后退變椎間盤高度指數(shù)百分比（DHI%）：對照組、4周組、12周組、20周組分別為(100±0)%、(81±3.2)%、(75±2.5)%、(71±1.8)%(P<0

2、.05)。退變椎間盤T2加權(quán)像信號明顯降低，Alcianblue組織染色顯示退變椎間盤組織中聚集蛋白多糖含量明顯降低。結(jié)論:抽吸法構(gòu)建兔椎間盤退變模型簡便可靠，其退變過程的病理及影像表現(xiàn)與人椎間盤退變過程的病理及影像表現(xiàn)十分相似，該退變模型可用于人椎間盤退變的機制與臨床治療研究?！娟P(guān)鍵詞】:抽吸法;椎間盤退變;動物模型；病理表現(xiàn)；影像學(xué)表現(xiàn)第二部分：髓核細(xì)胞對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用目的:探討在藻酸鹽微球的介導(dǎo)下，髓核細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)非接觸性共培養(yǎng)時,髓核細(xì)胞對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。方法:①4月齡健康新西蘭大耳白兔5只

3、，取髓核細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)，利用傳代法分離純化；②將純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化、收集，并與適量的藻酸鈉溶液混合，形成106個/ml的單細(xì)胞懸液，將混合好的單細(xì)胞懸液經(jīng)注射器滴加至3.5％的CaCl2溶液中，形成海藻酸鈣凝膠珠；③將海藻酸鈣凝膠微球與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)。在7天和15天時，分組溶解海藻酸鈣凝膠珠，收集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分2華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文別利用免疫組化技術(shù)、rt－PCR技術(shù)和Westernblot技術(shù)檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)，用以判斷髓核細(xì)胞對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在非接觸條件下的誘導(dǎo)作用。結(jié)果:在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞爬片免疫組化染

4、色中可見，細(xì)胞Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖染色陽性，rt-PCR和Westernblot結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中已有Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖基因的表達(dá)，且誘導(dǎo)15天組的目的條帶明顯亮于誘導(dǎo)7天組的目的條帶。結(jié)論:在體外非接觸共同培養(yǎng)時,髓核細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為髓核細(xì)胞，這必將為椎間盤退行性變的移植治療提供可靠的種子細(xì)胞來源?！娟P(guān)鍵詞】:骨髓基質(zhì)干細(xì)胞;髓核細(xì)胞;藻酸鈉微球；非接觸共同培養(yǎng)第三部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞的分化及永生化目的：嘗試?yán)霉才囵B(yǎng)法和SV40Tag永生化基因?qū)敕?gòu)建一種來源于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的永生化型類髓核

5、細(xì)胞。方法：取實驗白兔原代MSCs和髓核細(xì)胞（NPCs），熒光標(biāo)記NPCs；將標(biāo)記的NPCs與MSCs直接共培養(yǎng)6、9、12、15、18天；共培養(yǎng)完畢，利用流式細(xì)胞儀分選出熒光標(biāo)記陰性細(xì)胞，即MSCs；觀測共培養(yǎng)后MSCs細(xì)胞形態(tài)變化，檢測胞內(nèi)II型膠原和聚集蛋白多糖mRNA及蛋白的表達(dá)變化；共培養(yǎng)15天時，將含有SV40Tag永生化基因的pCMVSV40T/PUR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs，利用MTT法觀測轉(zhuǎn)染后MSCs增殖活性。結(jié)果：共培養(yǎng)后，MSCs胞內(nèi)表達(dá)大量的II型膠原和聚集蛋白多糖，細(xì)胞形態(tài)也從長橢圓形變?yōu)槎嘟切?；?dāng)共培養(yǎng)15天時，胞內(nèi)II型膠原和聚集蛋白多糖mRNA表達(dá)濃度達(dá)到最大值，

6、但低于原代NPCs胞內(nèi)II型膠原和聚集蛋白多糖mRNA含量（P<0.05）。導(dǎo)入SV40Tag基因后，MSCs-SV增殖能力與原代NPCs相同，傳代20次后其增殖能力無衰退（P<0.05）。3華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文結(jié)論：利用共培養(yǎng)法和SV40Tag永生化基因?qū)敕蓸?gòu)建出一種來源于MSCs的永生化型類髓核細(xì)胞；該類髓核細(xì)胞可能會對椎間盤退變的細(xì)胞移植治療研究起到一定得幫助作用?！娟P(guān)鍵詞】：共培養(yǎng)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；髓核細(xì)胞；永生化4華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文ABSTRACTPartI：ThePathologyandImagingPerformanceofRabbitDiscDegenera

7、tionModelInducedbytheAspirationofNucleusPulposusObjective:Toinvestigatetheuseofliposuctiontobuildrabbitmodelofdiscdegenerationandtoobservetheperformanceofitspathologyandimaging.Methods:Healthy10-month-oldNewZeala