3,5-二硝基水楊酸比色定糖法

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1、實驗一3，5-二硝基水楊酸比色定糖法目的要求1.掌握3，5-二硝基水楊酸比色法定糖的原理及方法。2.用3，5-二硝基水楊酸定糖法測定山芋份中的總糖度及還原糖。3.熟悉721型分光光度計的原理及使用方法實驗原理3，5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色強度呈比例關(guān)系，利用比色法可測知樣品的含糖量。該方法是半微量定糖法，操作簡便，快速，雜質(zhì)干擾較少。實驗操作方法一、葡萄糖標準曲線的制定取9支大試管，分別按下表順序加入各種試劑：將上述各管溶液混勻后，在721分光光度計上用520納米進行比色測定，用空

2、白管溶液調(diào)零點。記錄光吸收值。以葡萄糖濃度為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制出標準曲線。二、山芋粉中總糖和還原糖含量的測定1.樣品中還原糖的提?。簻蚀_稱取2克山芋粉，放入100毫升燒杯內(nèi)，加入85%乙醇50毫升，混勻，在50℃恒溫水浴中保溫30分鐘，過濾，濾渣再用85%乙醇提取二次。將濾液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100毫升容量瓶中，用水稀釋到刻度，備用。2.樣品中總糖的水解及提?。簻蚀_稱取山芋粉1克，放入大試管中，加入10毫升6N鹽酸和15毫升蒸餾水。混均，在沸水浴中加熱半小時后，用碘化鉀-碘溶液檢查水解程度。若已水解完全，則不呈現(xiàn)藍色。冷卻后加入

3、酚酞指示劑1滴，以10%氫氧化鈉中和至溶液呈微紅色。過濾并定容至100毫升。再精確吸取上述溶液10毫升，放人100毫升容量瓶中，稀釋刻刻度，備用。3.樣品中含糖量的測定：取7支大試管，分別按下表加入各種試劑：將各管混勻后，按制作標準曲線時同樣的操作測定各管的光密度，在標準曲線上查出相應(yīng)的還原糖含量，按下述公式計算出山芋粉內(nèi)還原糖與總糖的百分含量。試劑和器材一、試劑（1）3，5-二硝基水楊酸試劑（又稱DNS試劑）：甲液：溶解6.9克結(jié)晶酚于15.2毫升IO%氫氧化鈉中，并稀釋至69毫升，在此溶液中加入6.9克亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鈉，加到

4、300毫升10%氫氧化鈉中，再加入880毫升1%3，5-二硝基水楊酸溶液。將甲液與乙液相混合即得黃色試劑，貯于棕色試劑瓶中。在室溫下，放置7—10天以后使用。（2）0.1%葡萄糖標準液：準確稱取100毫克分析純的葡萄糖（預(yù)先在105℃干燥至恒重），用少量蒸餾水溶解后定容至100毫升，冰箱保存?zhèn)溆?。?）6N鹽酸溶液。（4）10%氫氧化鈉溶液。（5）碘化鉀-碘溶液（碘試劑）。（6）酚酞指示劑。（7）85%乙醇。二、器材（1）試管和試管架。（2）堿滴定管（50毫升）。（3）鐵臺。（4）滴定管夾。（5）吸量管（1毫升和2毫升）。（6）容量瓶（100毫升）。

5、（7）銅水浴鍋。（7）玻璃漏斗和燒杯。（9）鐵三腳架。（10）量筒（10毫升、100毫升）。（11）電熱恒溫水浴。（12）煤氣燈。（13）玻璃棒。（14）白瓷板。（15）721分光光度計思考題1.比色測定的操作要點是什么？基本原理是什么？2.721型分光光度計的原理及使用時的注意事項是什么？3.比色測定時為什么要設(shè)計空白管？4.總糖包括哪些化合物？答：1.（1）比色測定的操作要點：1.用相同型號的比色管.2.配制等體積的系列標準樣品.3.配制待測樣品(與標準樣品等體積).4.對比,找出相同的濃度.DNS法的原理是：在堿性條件下，還原糖與3,5-二硝基

6、水楊酸共熱，3,5-二硝基水楊酸被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，而還原糖則被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度量呈一定的比例關(guān)系，在540nm波長下測定棕紅色物質(zhì)的消光值，查對標準曲線可求出樣品中還原糖的含量。2.分光光度計的基本依據(jù)是朗伯—比耳定律，它是根據(jù)相對測量原理工作的，即先選定某一溶劑作為標準溶液，設(shè)定其透光率為100%，被測試樣的透光率是相對于標準溶液而言的，即讓單色光分別通過被測試樣和標準溶液，二者能量的比值就是在一定波長下對于被測試樣的透光率。實驗注意事項：（1）為了防止光電管疲勞，不測

7、定時必須將試樣室蓋打開，使光路切斷，以延長光電管的使用壽命。（2）取拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光學(xué)表面。（3）比色皿不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗滌，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附著的水或溶液應(yīng)用擦鏡紙或細而軟的吸水紙吸干，不要擦拭，以免損傷它的光學(xué)表面3.用空白管調(diào)整零位時，儀器和試劑等造成的系統(tǒng)誤差就可以抵消或減小到最低程度。上面說的是一般概念，在很多試驗中都是這樣做，或者以標準試樣做空白試驗，就是為了降低系統(tǒng)誤差。4.總糖主要指具有還原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在測定條件下能水解為還原性的單糖的蔗糖（水解后

8、為1分子葡萄糖和1分子果糖），麥芽糖（水解后為2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后為2分子葡萄糖）。