全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南

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1、附件2：流感監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作規(guī)范一、流感監(jiān)測(cè)臨床標(biāo)本的采集、運(yùn)送、處理及流感病毒株的運(yùn)輸（一）流感臨床標(biāo)本的采集病毒分離成功與否很大程度上取決于臨床標(biāo)本的采集時(shí)間、質(zhì)量及其保存和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)。多數(shù)標(biāo)本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次為氣管和支氣管分泌物及尸檢組織。標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４妗３Ｓ玫牟蓸右河幸韵氯N：pH7.4～7.6的Hank's、Eagle's或者DMEM培養(yǎng)基。為防止采樣液生長(zhǎng)細(xì)菌和真菌，在采樣液中可加入抗菌素，加入慶大霉素（終濃度為1mg/mL，Gibco,cat.no.15750-078）

2、和/或制霉菌素（終濃度為50U/mL）。加入抗菌素以后重新調(diào)節(jié)pH值至7.4，分裝每個(gè)采樣管3mL，-20℃凍存。常用采樣方法有以下幾種：1.鼻拭子：將帶有聚丙烯纖維頭的拭子平行于上顎插入鼻孔，旋轉(zhuǎn)，保持?jǐn)?shù)秒，待拭子頭吸收分泌物以后，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。以另一拭子拭另側(cè)鼻孔。將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。2.咽拭子：用帶有聚丙烯纖維頭的拭子適度用力擦拭雙側(cè)扁桃體及咽后壁，應(yīng)避免觸及舌部。同樣將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。注：亦可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高分離率，減少工作量。3.38鼻咽抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收

3、集器從鼻咽部抽取粘液。先將收集器頭部插入鼻腔，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用3～5mL采樣液涮洗收集器3次。此外，對(duì)于尸檢組織，必要時(shí)采集尸檢的肺組織標(biāo)本進(jìn)行病毒分離。（二）臨床標(biāo)本運(yùn)輸新鮮采集的臨床標(biāo)本應(yīng)在4℃條件下48h內(nèi)運(yùn)送至流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。未能48h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室的，應(yīng)置-70℃或以下保存。標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)盡快進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，48h內(nèi)能進(jìn)行檢測(cè)的可置于4℃保存，否則應(yīng)置-70℃或以下保存。凍存的臨床采集標(biāo)本應(yīng)在凍存的條件下，低溫送至實(shí)驗(yàn)室。凍存的標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)盡快進(jìn)行相應(yīng)實(shí)

4、驗(yàn)室檢測(cè)，48h內(nèi)能進(jìn)行檢測(cè)的可置于4℃保存，否則應(yīng)置-70℃或以下保存。標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。臨床標(biāo)本采集管建議使用帶螺口的塑料管。運(yùn)輸時(shí)在包裝箱內(nèi)填充吸水材料，運(yùn)輸過(guò)程中保持標(biāo)本采集管直立狀態(tài)，不能傾斜。（三）臨床標(biāo)本處理臨床采集標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室后，須經(jīng)處理后再進(jìn)行病毒的分離接種。若為帶有聚丙烯纖維的拭子標(biāo)本，應(yīng)先將帶有聚丙烯纖維的拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出。鼻咽抽取液：用干凈滅菌的毛細(xì)吸管在無(wú)菌條件下反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上清。上清液可直接接種或低溫保存。38組織標(biāo)本的處理：

5、取肺組織標(biāo)本放至平皿中，用滅菌生理鹽水清洗肺組織2～3遍，研磨成組織懸液，配置成10％～20％的組織懸液，2000rpm離心10min，加入抗菌素，取上清直接接種。注：如原始采樣液中未加入抗菌素，應(yīng)在標(biāo)本接種前補(bǔ)加，慶大霉素終濃度為10mg/mL，青/鏈霉素（終濃度:青霉素G100U/mL,硫酸鏈霉素100μg/mL），混勻后置4℃過(guò)夜或作用2h后進(jìn)行接種。臨床標(biāo)本處理后，將原始標(biāo)本分為三份，一份用于雞胚接種，一份用于MDCK細(xì)胞接種，一份保存待復(fù)核用。對(duì)于病毒分離陽(yáng)性的原始標(biāo)本-70℃至少保存6個(gè)月，在收到國(guó)家流感中心復(fù)

6、核鑒定報(bào)告后，按照生物安全有關(guān)規(guī)定處理；病毒分離陰性的標(biāo)本隨時(shí)按生物安全的有關(guān)規(guī)定處理。（四）血清標(biāo)本的采集、處理、運(yùn)輸和保存血清標(biāo)本多用于流感暴發(fā)時(shí)的血清學(xué)核實(shí)診斷。血清標(biāo)本采集應(yīng)該包括急性期和恢復(fù)期雙份血清,單份血清不能用作診斷。急性期血樣應(yīng)盡早采集，可在采集病毒分離標(biāo)本的同時(shí)采集，但不能晚于發(fā)病后7天?；謴?fù)期血樣則在發(fā)病后2～4周采集。一般采集空腹血。1.取一根體積5mL以上，無(wú)菌的血清管做好標(biāo)記，并進(jìn)行登記。登記的內(nèi)容包括：醫(yī)院名稱、患者姓名、性別、急性期（Acute，A）或是恢復(fù)期（Convalescence，C

7、）、采樣日期（年，月，日）。2.從患者手臂靜脈采5mL血，放入準(zhǔn)備好的上述血清管中。3.放置于室溫?cái)?shù)小時(shí)待血液完全凝固。4.1500～2000rpm離心10min，收集血清于無(wú)菌管中，做好標(biāo)記。5.無(wú)菌條件下采集的血清可置4℃存放138周，非無(wú)菌條件下采集的或存放超過(guò)1周的血清需置-20℃或以下保存。應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。（五）流感病毒株的運(yùn)輸需送國(guó)家流感中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的流感毒株，在流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)填寫“流感毒株送檢單”，提交并打印送檢單，加蓋單位公章。在凍存后，低溫條件下，送至國(guó)家流感中心進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，運(yùn)輸時(shí)應(yīng)遵守國(guó)家生物

8、安全的有關(guān)規(guī)定。1.流感毒株的送檢要求（1）流感樣病例標(biāo)本各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室對(duì)所有血凝滴度≥1：16的流感毒株，同時(shí)分別上送國(guó)家流感中心和省級(jí)疾病預(yù)防控制中心，送檢量每份不少于3mL。各網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室分離的毒株從標(biāo)本采集到送至國(guó)家流感中心的時(shí)間不超過(guò)1個(gè)月。每個(gè)開展病毒分離的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室每年向國(guó)家流感中心上送不低于