全國流感監(jiān)測技術(shù)指南

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1、附件2：流感監(jiān)測實驗技術(shù)操作規(guī)范一、流感監(jiān)測臨床標本的采集、運送、處理及流感病毒株的運輸（一）流感臨床標本的采集病毒分離成功與否很大程度上取決于臨床標本的采集時間、質(zhì)量及其保存和運輸?shù)拳h(huán)節(jié)。多數(shù)標本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次為氣管和支氣管分泌物及尸檢組織。標本采集后應(yīng)立即放入適當?shù)牟蓸右褐械蜏乇４妗３Ｓ玫牟蓸右河幸韵氯N：pH7.4～7.6的Hank's、Eagle's或者DMEM培養(yǎng)基。為防止采樣液生長細菌和真菌，在采樣液中可加入抗菌素，加入慶大霉素（終濃度為1mg/mL，Gibco,cat.no.15750-078）和/或制

2、霉菌素（終濃度為50U/mL）。加入抗菌素以后重新調(diào)節(jié)pH值至7.4，分裝每個采樣管3mL，-20℃凍存。常用采樣方法有以下幾種：1.鼻拭子：將帶有聚丙烯纖維頭的拭子平行于上顎插入鼻孔，旋轉(zhuǎn)，保持數(shù)秒，待拭子頭吸收分泌物以后，緩慢轉(zhuǎn)動退出。以另一拭子拭另側(cè)鼻孔。將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。2.咽拭子：用帶有聚丙烯纖維頭的拭子適度用力擦拭雙側(cè)扁桃體及咽后壁，應(yīng)避免觸及舌部。同樣將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。注：亦可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高分離率，減少工作量。3.38鼻咽抽取物：用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取

3、粘液。先將收集器頭部插入鼻腔，接通負壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用3～5mL采樣液涮洗收集器3次。此外，對于尸檢組織，必要時采集尸檢的肺組織標本進行病毒分離。（二）臨床標本運輸新鮮采集的臨床標本應(yīng)在4℃條件下48h內(nèi)運送至流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室。未能48h內(nèi)送至實驗室的，應(yīng)置-70℃或以下保存。標本送至實驗室后，應(yīng)盡快進行相應(yīng)實驗室檢測，48h內(nèi)能進行檢測的可置于4℃保存，否則應(yīng)置-70℃或以下保存。凍存的臨床采集標本應(yīng)在凍存的條件下，低溫送至實驗室。凍存的標本送到實驗室后，應(yīng)盡快進行相應(yīng)實驗室檢測，48h內(nèi)能進行

4、檢測的可置于4℃保存，否則應(yīng)置-70℃或以下保存。標本應(yīng)避免反復(fù)凍融。臨床標本采集管建議使用帶螺口的塑料管。運輸時在包裝箱內(nèi)填充吸水材料，運輸過程中保持標本采集管直立狀態(tài)，不能傾斜。（三）臨床標本處理臨床采集標本送至實驗室后，須經(jīng)處理后再進行病毒的分離接種。若為帶有聚丙烯纖維的拭子標本，應(yīng)先將帶有聚丙烯纖維的拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出。鼻咽抽取液：用干凈滅菌的毛細吸管在無菌條件下反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上清。上清液可直接接種或低溫保存。38組織標本的處理：取肺組織標本放至平皿中，用滅菌生

5、理鹽水清洗肺組織2～3遍，研磨成組織懸液，配置成10％～20％的組織懸液，2000rpm離心10min，加入抗菌素，取上清直接接種。注：如原始采樣液中未加入抗菌素，應(yīng)在標本接種前補加，慶大霉素終濃度為10mg/mL，青/鏈霉素（終濃度:青霉素G100U/mL,硫酸鏈霉素100μg/mL），混勻后置4℃過夜或作用2h后進行接種。臨床標本處理后，將原始標本分為三份，一份用于雞胚接種，一份用于MDCK細胞接種，一份保存待復(fù)核用。對于病毒分離陽性的原始標本-70℃至少保存6個月，在收到國家流感中心復(fù)核鑒定報告后，按照生物安全有關(guān)規(guī)定處理；

6、病毒分離陰性的標本隨時按生物安全的有關(guān)規(guī)定處理。（四）血清標本的采集、處理、運輸和保存血清標本多用于流感暴發(fā)時的血清學核實診斷。血清標本采集應(yīng)該包括急性期和恢復(fù)期雙份血清,單份血清不能用作診斷。急性期血樣應(yīng)盡早采集，可在采集病毒分離標本的同時采集，但不能晚于發(fā)病后7天?；謴?fù)期血樣則在發(fā)病后2～4周采集。一般采集空腹血。1.取一根體積5mL以上，無菌的血清管做好標記，并進行登記。登記的內(nèi)容包括：醫(yī)院名稱、患者姓名、性別、急性期（Acute，A）或是恢復(fù)期（Convalescence，C）、采樣日期（年，月，日）。2.從患者手臂靜脈采

7、5mL血，放入準備好的上述血清管中。3.放置于室溫數(shù)小時待血液完全凝固。4.1500～2000rpm離心10min，收集血清于無菌管中，做好標記。5.無菌條件下采集的血清可置4℃存放138周，非無菌條件下采集的或存放超過1周的血清需置-20℃或以下保存。應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。（五）流感病毒株的運輸需送國家流感中心實驗室檢測的流感毒株，在流感監(jiān)測信息系統(tǒng)填寫“流感毒株送檢單”，提交并打印送檢單，加蓋單位公章。在凍存后，低溫條件下，送至國家流感中心進行復(fù)核檢測，運輸時應(yīng)遵守國家生物安全的有關(guān)規(guī)定。1.流感毒株的送檢要求（1）流感樣病例標

8、本各網(wǎng)絡(luò)實驗室對所有血凝滴度≥1：16的流感毒株，同時分別上送國家流感中心和省級疾病預(yù)防控制中心，送檢量每份不少于3mL。各網(wǎng)絡(luò)實驗室分離的毒株從標本采集到送至國家流感中心的時間不超過1個月。每個開展病毒分離的網(wǎng)絡(luò)實驗室每年向國家流感中心上送不低于