單克隆抗體的制備、純化及鑒定

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1、單克隆抗體的制備、純化及鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簡(jiǎn)慰寺】贵w制備是細(xì)胞免疫學(xué)的一個(gè)重要里程碑，它涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、免疫動(dòng)物和抗體效價(jià)檢測(cè)等各個(gè)方面內(nèi)容。了解單克隆抗體制備的原理、主要步驟和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；而抗原免疫的B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個(gè)親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無限制增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。經(jīng)在HAT培養(yǎng)基[含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，未

2、融合的脾細(xì)胞因不能在體外長(zhǎng)期存活而死亡；未融合的骨髓瘤細(xì)胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤完成DNA的合成過程而死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，即可無限制地大量制備單克隆抗體。三、試劑與器材：細(xì)胞培養(yǎng)板、解剖器械、平皿、酶標(biāo)儀、加樣器、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡等。四、操作方法：1、抗原制備；一般而言，抗原的純

3、度不很重要，特別是免疫原性較強(qiáng)的抗原。A．可溶性抗原（蛋白質(zhì)）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點(diǎn)小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔３～５周再同樣注射一次，１０天后，斷尾取血一滴，測(cè)抗體效價(jià)，選滴度高的小鼠做融合試驗(yàn)。一個(gè)月后可以經(jīng)靜脈（尾靜脈）給予無佐劑抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，殺死小鼠取脾做融合用。B.顆粒性抗原如抗原來源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時(shí)間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以１％濃度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人認(rèn)為最后一次免疫劑量要大

4、，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫動(dòng)物；目前應(yīng)用最廣的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠為好。就品系而言以Balb/c小白鼠應(yīng)用最廣，因?yàn)樗械男“资蠊撬枇鱿稻鶑腂alb/c小白鼠系誘導(dǎo)出來。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。大白鼠也可，能產(chǎn)生較多量的單克隆抗體?，F(xiàn)在已經(jīng)在小鼠雜交瘤的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人雜交瘤技術(shù)。免疫程序、劑量和方法是關(guān)系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關(guān)鍵之一。正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞，一只純種小白鼠估計(jì)能產(chǎn)生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的

5、脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬分之一的機(jī)會(huì)獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機(jī)會(huì)，必須加強(qiáng)免疫，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加。B淋巴細(xì)胞的不同發(fā)育階段對(duì)獲得陽性雜交瘤也有很大影響。有人認(rèn)為處在轉(zhuǎn)化時(shí)期的B淋巴細(xì)胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，雖然是抗體產(chǎn)生的高峰時(shí)期，但形成有活力的雜交瘤細(xì)胞的可能反而減少。故一般認(rèn)為加強(qiáng)免疫后的第三天應(yīng)殺鼠取脾做細(xì)胞融合。3、免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；脾細(xì)胞制備(1)免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠，拉頸或用CO2處死小白鼠。(2)將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾

6、。(3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。(4)用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。(5)直立小試管3min，使大塊的結(jié)締組織下沉，把細(xì)胞懸液移入離心管中。(6)以2.5％FCS—1640充滿離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時(shí)應(yīng)開始制備骨髓細(xì)胞）。(7)把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。(8)重復(fù)⑹、⑺步驟。(9)計(jì)算細(xì)胞，以臺(tái)盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細(xì)胞數(shù)應(yīng)高于80％為合格。骨髓瘤細(xì)胞制備骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細(xì)胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的

7、滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞。選擇骨髓瘤細(xì)胞的條件：①該瘤細(xì)胞系的來源應(yīng)與制備脾細(xì)胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細(xì)胞必須是靜息狀態(tài)，不產(chǎn)生γ球蛋白或不分泌到細(xì)胞外；③骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)較高的細(xì)胞密度,最好106個(gè)細(xì)胞/ml；④生長(zhǎng)速度快，繁殖時(shí)間短。目前常用的Balb/c小鼠產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（簡(jiǎn)稱SP2）；③P2—X？—Ag8·6·5·3（簡(jiǎn)稱653）；④FO以653最為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane