單克隆抗體的制備、純化及鑒定

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1、單克隆抗體的制備、純化及鑒定一、實驗目的：單克隆抗體制備是細胞免疫學的一個重要里程碑，它涵蓋了細胞培養(yǎng)、細胞融合、免疫動物和抗體效價檢測等各個方面內容。二、實驗原理：骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；而抗原免疫的B淋巴細胞能產生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了兩個親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限制增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗體的能力。經在HAT培養(yǎng)基[含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中進行選擇性培養(yǎng)，未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡；未融合的骨髓

2、瘤細胞合成DNA的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤完成DNA的合成過程而死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經過克隆選擇，可篩選出能產生特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，在體內或體外培養(yǎng)，即可無限制地大量制備單克隆抗體。三、試劑與器材：細胞培養(yǎng)板、解剖器械、平皿、酶標儀、加樣器、細胞計數(shù)板、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡等。四、操作方法：1、抗原制備；一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強的抗原。A．可溶性抗原（蛋白質）

3、以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐劑乳化，分多點小鼠皮下注射，總量為0.3ml～0.6ml，間隔３～５周再同樣注射一次，１０天后，斷尾取血一滴，測抗體效價，選滴度高的小鼠做融合試驗。一個月后可以經靜脈（尾靜脈）給予無佐劑抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，殺死小鼠取脾做融合用。9B.顆粒性抗原如抗原來源方便，可以不加佐劑而增加免疫次數(shù)，縮短間隔時間。例如用羊紅血球免疫小白鼠，以１％濃度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人認為最后一次免疫劑量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫動物；目前應用最廣的是小白鼠和大

4、白鼠，尤以小白鼠為好。品系以Balb/c小白鼠應用最廣，因為所有的小白鼠骨髓瘤系均從Balb/c小白鼠系誘導出來。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。免疫程序、劑量和方法關系到能否得到所需要的單克隆抗體的關鍵之一。正常小鼠脾臟含有能產生各種不同抗體的B淋巴細胞，一只純種小白鼠能產生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬分之一的機會獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機會，必須加強免疫，使產生特異性抗體的B淋巴細胞大量增加。B淋巴細胞的不同發(fā)育階段對獲得陽性雜交瘤也有很大影響。有人

5、認為處在轉化時期的B淋巴細胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，雖然是抗體產生的高峰時期，但形成有活力的雜交瘤細胞的可能反而減少。故一般認為加強免疫后的第三天應殺鼠取脾做細胞融合。3、免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備；脾細胞制備(1)免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠，拉頸或用CO2處死小白鼠。(2)將小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾。(3)把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。(4)用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細胞懸液，用毛細管將懸液移入小試管中。(5)直立小試管3min，使大塊的結締組織下沉，把細胞懸液移入離心管

6、中。(6)以2.5％FCS—1640充滿離心管，并以400g離心7min～10min（與此同時應開始制備骨髓細胞）。(7)把沉淀用約10ml的新鮮培養(yǎng)液再懸浮。(8)重復⑹、⑺步驟。(9)計算細胞，以臺盼蘭染色用相差顯微鏡檢查，活細胞數(shù)應高于80％為合格。9骨髓瘤細胞制備骨髓瘤細胞能產生并分泌大量的免疫球蛋白，這樣的瘤細胞融合后，可能影響或降低所分泌抗體的滴度，所以必須選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞。選擇骨髓瘤細胞的條件：①該瘤細胞系的來源應與制備脾細胞小鼠為同一品系，以便兩者的組織相容性抗原一致；②骨髓瘤細胞必須是靜息狀態(tài)，不產生γ球蛋白或不分泌到細胞外；③骨髓瘤細胞

7、生長需要一個較高的細胞密度,最好106個細胞/ml；④生長速度快，繁殖時間短。目前常用的Balb/c小鼠產生的骨髓瘤細胞株有：①S194/5XXO·BU·1；②SP2／0—Ag14（簡稱SP2）；③P2—X？—Ag8·6·5·3（簡稱653）；④FO以653最為常用，它是由礦物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）誘發(fā)出來的一種漿細胞瘤（MinerolOilplasmacytoma，MOPC）并經過培育形成一株8-氮鳥嘌呤有抵抗力的亞系。骨髓瘤細胞一般由有關單位直接引入