高效液相色譜原理和操作詳解

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1、高效液相色譜我國藥典收載高效液相色譜法項目和數(shù)量比較表：方法項目數(shù)量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鑒別934150檢查1240160含量測定760117387鑒于HPLC應(yīng)用在藥品分析中越來越多，因此每一個藥品分析人員應(yīng)該掌握并應(yīng)用HPLC。I．概論2一、液相色譜理論發(fā)展簡況2二、HPLC的特點和優(yōu)點2三、色譜法分類3四、色譜分離原理3II．基本概念和理論5一、基本概念和術(shù)語5二、塔板理論8三、速率理論（又稱隨機(jī)模型理論）9III．HPLC系統(tǒng)10一、輸液泵11二、進(jìn)樣器1

2、3三、色譜柱14四、檢測器17五、數(shù)據(jù)處理和計算機(jī)控制系統(tǒng)20六、恒溫裝置20IV．固定相和流動相20一、基質(zhì)（擔(dān)體）20二、化學(xué)鍵合固定相22三、流動相231．流動相的性質(zhì)要求232．流動相的選擇243．流動相的pH值244．流動相的脫氣255．流動相的濾過256．流動相的貯存267．鹵代有機(jī)溶劑應(yīng)特別注意的問題268．HPLC用水26V．HPLC應(yīng)用27一、樣品測定27二、方法研究27附件：高效液相色譜法（HPLC）復(fù)核細(xì)則28一、對起草單位的要求：28二、對復(fù)核單位的要求：28I．概論一、液相色

3、譜理論發(fā)展簡況色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發(fā)現(xiàn)的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。液相色譜法開始階段是用大直

4、徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相

5、色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也稱現(xiàn)代液相色譜。二、HPLC的特點和優(yōu)點HPLC有以下特點：高壓——壓力可達(dá)150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速——流速為0.1~10.0ml/min。高效——可達(dá)5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：速度快——通常分析一個樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即

6、可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高——紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。三、色譜法分類按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)

7、定性差的物質(zhì)。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。（此外還有電泳。）按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。四、色

8、譜分離原理高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。1．液固色譜法　使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。2．液液色譜法　使用將特定