變性高效液相色譜原理

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1、高效液相色譜原理DHPLC變性高效液相色譜技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的分析技術(shù)，它是分離核苷酸片段及分析檢測(cè)已知未知基因突變和SNP的最佳技術(shù)平臺(tái)，其核心技術(shù)采用Transgenomic公司專利技術(shù)的DNASepCartridge分離柱。DHPLC能夠分析檢測(cè)已知未知突變和SNP，技術(shù)關(guān)鍵是依靠這樣專利技術(shù)的分離系統(tǒng)，在專利技術(shù)的DNASepCartridge分離柱中的基質(zhì)為聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）交聯(lián)聚合物微球體，固定相為碳-18烷烴鏈，PS-DVB微球體與碳-18烷烴鏈之間形成碳碳共價(jià)鍵共同組成柱填

2、料，填料是電中性、疏水性的，不易與核酸發(fā)生反應(yīng)。三乙基銨醋酸鹽（TEAA）是一種離子對(duì)試劑，離子對(duì)試劑既是疏水性的又帶正電荷，既能與核酸主鏈上的磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷反應(yīng)，同時(shí)TEAA的疏水基團(tuán)又與固定相碳-18鏈的疏水基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。這種離子對(duì)試劑是連接核酸和柱基質(zhì)之間的橋梁，因此，它作為“橋分子”使DNA片段吸附在固定相上面。通過(guò)改變流動(dòng)相中乙氰及離子對(duì)試劑的濃度實(shí)現(xiàn)DNA片段的分離。WAVE?DHPLC分離系統(tǒng)的三種操作模式：WAVE?系統(tǒng)是一套經(jīng)濟(jì)、高效及多用途的儀器。標(biāo)準(zhǔn)WAVE系統(tǒng)提供可選擇的冷卻設(shè)備、雙板自動(dòng)進(jìn)

3、樣器、柱箱、紫外檢測(cè)器和分離柱組成。這套系統(tǒng)可在同一分析標(biāo)準(zhǔn)下實(shí)現(xiàn)三種模式的運(yùn)行。將標(biāo)準(zhǔn)WAVE系統(tǒng)加工和升級(jí)可以進(jìn)一步提升系統(tǒng)的可用性。執(zhí)行模式溫度應(yīng)用分離基礎(chǔ)非變性50℃測(cè)量雙螺旋DNA的大?。ㄐ∮?000bp）?依賴大小?????????????????????PCR質(zhì)量檢測(cè)及純化依賴序列?????????????????????定量分析部分變性52-75℃變性檢測(cè)依賴大?。ㄆ骄秶﹩魏怂岫鄳B(tài)性檢測(cè)依賴序列完全變性75-80℃測(cè)量雙螺旋DNA大?。ㄐ∮?000bp）依賴大?。ㄆ骄秶〥NA分析（DNASep

4、R柱）依賴序列寡核苷酸質(zhì)量（DNASepR柱和OLIGOSepR柱）和純度分析（片段收集器）大量純化需要OLIGOSepPrepTMHC柱非變性條件：依賴分子量的分離WAVEMAKERTM軟件能根據(jù)DNA片段分子量大小最大限度完善分離條件。在這些條件下，序列順序并非是決定DNA洗脫方式的因素。系統(tǒng)在50℃運(yùn)行，堿基對(duì)的數(shù)量決定洗脫順序。這種應(yīng)用在非變性條件下能將染色體插入和缺失片段分開(kāi)。一般說(shuō)來(lái)，產(chǎn)物分子量的1%大小的片段能夠被分離。例如，100bp的產(chǎn)物能和101bp的產(chǎn)物分開(kāi)，300bp的產(chǎn)物能和303bp的產(chǎn)物

5、分開(kāi)。分子量較小的核酸片段含有相應(yīng)較少的磷酸鹽基團(tuán)結(jié)合柱基質(zhì)，而分子量較大的片段則含有較多的磷酸鹽基團(tuán)結(jié)合柱基質(zhì)。因此，當(dāng)我們將過(guò)柱的乙腈濃度提高，核酸片段就會(huì)根據(jù)分子量從小到大的順序被洗脫出來(lái)。在不包括柱溫度和堿基對(duì)序列的影響下，這種柱運(yùn)行模式已被證明是正確的。對(duì)于想用一些已知片段大小的核酸梯度檢驗(yàn)其PCR反應(yīng)的顧客，我們推薦用這種方法。部分變性條件：根據(jù)片段大小，序列和溫度的分離WAVEMAKER軟件也能預(yù)測(cè)突變檢測(cè)的分析條件。在部分變性的條件下，分離不同成分是根據(jù)核酸的大小、序列以及分析溫度。以下是變性檢測(cè)技術(shù)

6、原理的闡述，以及它是如何應(yīng)用的。先設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，使最大不超過(guò)600bp的PCR產(chǎn)物覆蓋你所感興趣的序列。然后將PCR樣本移入一塊96微孔金屬板的孔中，登錄WAVE系統(tǒng)分析。在這步后，你就不再需要操作員的進(jìn)一步幫助。在單核苷酸突變或多態(tài)性雜交個(gè)體中，野生型DNA和突變型DNA的比率是1：1。加熱至95℃，然后慢慢冷卻，使PCR產(chǎn)物雜交形成同源雙鏈和異源雙鏈的混合。在分析含有兩個(gè)等位基因（純合突變）的DNA時(shí)，這種方法需要稍微修改一些。覆蓋純合突變點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與野生型擴(kuò)增DNA混合并雜交。在這步驟后，樣本包括異源

7、和同源雙螺旋的混合物。WAVE的分析系統(tǒng)在能在足以使DNA異源雙鏈變性（融解）的溫度下運(yùn)行。融解的異源雙鏈在離子對(duì)反相液相色譜層析與相應(yīng)的同源雙鏈分離。這個(gè)過(guò)程也稱為溫度調(diào)控的異源雙鏈層析或分析。在DNASep柱基質(zhì)中的精確保留時(shí)間使得對(duì)單核苷酸多態(tài)性（SNP）和短串聯(lián)重復(fù)序列（STRs）的高靈敏、快速檢測(cè)成為可能。在這里我們應(yīng)用的一個(gè)范例是位于基因座位DYS271上，位點(diǎn)168的核苷酸發(fā)生從腺嘌呤到鳥(niǎo)嘌呤的突變。圖4-5顯示了運(yùn)用WAVE系統(tǒng)在一定范圍溫度變化下四種相應(yīng)的雜交產(chǎn)物。在用于測(cè)定DNA片段大小的非變性條

8、件下（50℃），所有四種雜交產(chǎn)物都有著相同的保留時(shí)間。當(dāng)溫度上升到54℃時(shí)，異源雙鏈復(fù)制物開(kāi)始在錯(cuò)配堿基兩側(cè)區(qū)域變性。這種變性導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的雙鏈比例減少。在洗脫溫度下，單鏈DNA片段比雙鏈片段更早洗脫。這主要是因?yàn)樵趩捂溒畏肿拥呢?fù)電荷與雙鏈相比較少。因此，異源雙鏈PCR產(chǎn)物比同源雙鏈含有更高的單鏈的比例，保留時(shí)間更短。當(dāng)同源雙鏈DNA還尚未