熒光原位雜交(fish)

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1、FISH-熒光原位雜交實驗（原位雜交）1.實驗?zāi)康摹　⊥ㄟ^實驗了解熒光原位雜交技術(shù)的基本原理和在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。掌握原位雜交技術(shù)的操作方法，熟練掌握熒光顯微鏡的使用方法。2.實驗原理　　熒光原位雜交（FluorescenceinsituhybridizationFISH）是一門新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期在原有放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。FIS

2、H的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特性高和可以多重染色等特點，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注?！　‰s交所用的探針大致可以分為三類：1）染色體特異重復(fù)序列探針，例如a衛(wèi)星、衛(wèi)星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復(fù)序列，與靶位結(jié)合緊密，雜交信

3、號強，易于檢測；2）全染色體或染色體區(qū)域特異性探針，其由一條染色體或染色體上某一區(qū)段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆到噬菌體和質(zhì)粒中的染色體特異大片段獲得；3）特異性位置探針，由一個或幾個克隆序列組成。探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物系標(biāo)記的dUTP(biotin-dUTP)經(jīng)過缺口平移法進(jìn)行標(biāo)記，雜交之后用藕聯(lián)的熒光素的抗生物系的抗體進(jìn)行檢測，同時還可以利用幾輪抗生物素蛋白—熒光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—熒光素的處理，將熒光信號進(jìn)行放大，從而可以檢測500bp的片段。而直接標(biāo)記法是

4、將熒光素直接與探針核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共價結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測時步驟簡單，但由于不能進(jìn)行信號放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。3.實驗用具及材料　　Y染色體探針、人外周血中期染色體細(xì)胞標(biāo)本、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、染色缸、載玻片、NikonE-400、熒光顯微鏡、蓋玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲酰胺、氯化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、吐溫20。4.實驗方法及步驟1）探針及標(biāo)本的變性（1）探針變性將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈

5、DNA探針變性。（2）標(biāo)本變性①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）②取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。③立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。2）雜交將已變性或預(yù)退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交

6、溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。3）洗脫此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。（1）雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。（2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。（3）在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。（4）在室溫下，將玻片標(biāo)本2×SSC中輕洗一下。4）雜交信號的放大（1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。（2）去掉保鮮膜，再加150mL

7、avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。（3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。（4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。（5）去掉保鮮膜，加150mLantiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。（6）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。（7）重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。（8）取出玻片，自然干燥。（9）取200mLPI/antifade染

8、液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。5）封片可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封